La photométrie des milieux troubles

Thèmes abordés

Photométrie, milieux troubles, lumière, particules en suspension, turbidimétrie, néphélémétrie

Résumé du document

Photométrie des milieux troubles  :
- Méthode de mesure physique.
- Repose sur la diffusion de la lumière par des particules en suspension.
- Ni les atomes, ni les molécules ne sont concernés.
- La diffusion est « élastique » : pas de variation d'énergie mais seulement un changement de l'intensité et de la direction de la lumière.
- En pratique courante, s'effectue selon deux modalités : turbidimétrie et néphélémétrie.

Extraits

[...] ) Marqueurs de l‘état nutritionnel (albumine, transthyrétine, retinol binding protein . ) Marqueurs du statut martial (transferrine, ferritine, récepteur soluble de la transferrine) < number > Applications en biologie clinique : Dosages des protéines spécifiques du sérum et du plasma : Marqueurs de l‘état inflammatoire (CRP, orosomucoide, haptoglobine, α2-acroglobuline . [...]

[...] ) Céruloplasmine Fibronectine α1-antitrypsine . [...]

[...] Marqueurs du bilan lipidique (apolipoprotéines A1 et Lpa . ) Protéines de la coagulation (antithrombine III, fibrinogène . [...]

[...] Photométrie des milieux troubles Introduction : Photométrie des milieux troubles : Méthode de mesure physique Repose sur la diffusion de la lumière par des particules en suspension Ni les atomes, ni les molécules ne sont concernés La diffusion est « élastique » : pas de variation d'énergie mais seulement un changement de l'intensité et de la direction de la lumière En pratique courante, s'effectue selon deux modalités : turbidimétrie et néphélémétrie < number > Introduction : Photométrie des milieux troubles : Turbidimétrie : mesurer l'intensité de la lumière transmise dans la direction du faisceau incident Néphélémétrie : déterminer l'intensité de la lumière diffusée dirigée dans une autre direction que la lumière incidente < number > Introduction : Intérêt de la question : Techniques largement utilisées en biologie médicale, hydrologie et en agro-alimentaire Application majeure dans les dosages des protéines spécifiques par immunoprécipitation en milieu liquide (immunoturbidimétrie et immunonéphélémétrie ) Objectifs : Principes Appareillages Applications < number > Plan : Principes Appareillage Mise en œuvre Applications Conclusion < number > Principes : Principes généraux de la diffusion de la lumière en milieu trouble : Des particules en suspension traversées par un rayon lumineux de lumière blanche diffusent la lumière Cette lumière diffusée apparait bleue sous un angle de 90° mais elle apparait rouge au niveau du faisceau incident Cet effet a été décrit par Tyndall et fut quantifié par Lord Rayleigh < number > Principes : Turbidimétrie : Consiste à mesurer l'intensité de la lumière transmise Dans la direction du faisceau incident Permet d'apprécier la diminution d'intensité de la lumière incidente après traversée de la cuve de mesure La baisse de l'intensité du rayonnement incident est donnée par la relation de Beer-Lambert à condition que la taille et la concentration des particules soient faibles : < number > Principes : Turbidimétrie : C I0 : Intensité initiale I : Intensité du rayon émergent suivant la direction initiale L : Épaisseur du milieu k : 2.303 τ τ : Coefficient de turbidité (facteur de proportionnalité) < number > Principes : Turbidimétrie : La courbe de calibration entre log I0/I est tracé en fonction de la concentration C La mesure est comparée à celles obtenues avec une gamme d'étalonnage établie dans les mêmes conditions La précision de la méthode est meilleure avec des solutions de turbidité élevée pour lesquelles on constate une diminution significative de la lumière transmise < number > Principes : Néphélométrie : Consiste à déterminer l'intensité de la lumière diffusée dirigée dans une autre direction que la lumière incidente La mesure se fait selon un angle Ѳ par rapport au rayon incident qui a traversé la cuve Applicable surtout aux suspensions diluées pour lesquelles la réflexion et l'auto-absorption sont minimales : < number > Principes : Néphélométrie : l'intensité du rayonnement diffusé est donnée par la loi de Rayleigh: ID : intensité du rayonnement diffusé I0 : intensité du rayonnement incident n : indice de réfraction de la substance n0 : indice de réfraction du milieu V : volume moyen des particules, supposées sphériques N : nombre des particules K : constante qui fait intervenir l'angle d'observation < number > Principes : Néphélométrie : Conditions : Nombre de particules dans la suspension est faible Leur diamètre est inférieur à la longueur d'onde λ de la lumière incidente Leur indice de réfraction « n » ne diffère pas trop de celui du milieu « n0 » ID dépend du nombre de particules, et permet d'accéder à leur «concentration » Expérimentalement, on note une relation linéaire de ID en fonction de la «concentration» des particules dispersées. < number > Principes : Néphélométrie : Là aussi la mesure de la solution inconnue est comparée à celles d'une gamme d'étalonnage Une tendance trop rapide à la sédimentation provoque d'importantes variations du nombre de particules par unité de volume Les suspensions examinées doivent être stables. [...]

[...] La néphélométrie est plus précise et plus sensible que la turbidimétrie < number > Appareillages : Turbidimètre : Comprend : Source lumineuse Sélecteur de longueur d'onde Cuve Dispositif d'élimination de la lumière diffusée Détecteur relié à un enregistreur < number > Appareillages : Turbidimètre : Source lumineuse : Usuellement, dans les deux techniques, les sources lumineuses fournissent des faisceaux à des longueurs d'onde allant de 340 à 650 nm. Ainsi, on utilise : Arc de mercure Arc au xénon Lampe tungstène avec monochromateur de 400-550 nm Lampe laser hélium-néon qui émet à λ = 632,8 nm Lampe laser hélium-cadmium qui émet à λ = 441,6 nm < number > Appareillages : Turbidimètre : Dispositif de sélection de longueur d'onde : Pour obtenir un rayonnement monochromatique, il est nécessaire de décomposer la lumière polychromatique fournie par la lampe en ses différents constituants et de sélectionner une longueur d'onde donné: Filtres : colorés ou interférentiels Monochromateur : constitué d'une fente d'entré de la lumière avec un système de dispersion de la lumière qui peur être un prisme ou un réseau < number > Appareillages : Turbidimètre : Dispositif de sélection de longueur d'onde : < number > Appareillages : Turbidimètre : Cuve : Faces parallèles Transparente pour les longueurs d'ondes utilisées < number > Appareillages : Turbidimètre : Dispositif permettant d'éliminer la lumière diffusée : La lumière transmise dans l'axe du faisceau incident, après avoir traverser la cuve contenant l'échantillon, comprend: la lumière transmise proprement dite (dont l'axe de rayonnement reste parallèle à l'axe du faisceau incident) et une partie de la lumière diffusée (se trouve repartie dans un cône situé autour du faisceau émergent) Le problème est d'éliminer cette lumière diffusée < number > Appareillages : Turbidimètre : Dispositif permettant d'éliminer la lumière diffusée : La lumière diffusée peut être éliminé : Soit en interposant un système de fentes ou cylindre métallique creusé de canaux, entre la cuve et le récepteur < number > Appareillages : Turbidimètre : Dispositif permettant d'éliminer la lumière diffusée : La lumière diffusée peut être éliminé : Soit en interposant une lentille convergente et un diaphragme entre la cuve et le détecteur < number > Appareillages : Turbidimètre : Détecteur : Le détecteur convertit en un signal électrique l'intensité de la radiation lumineuse qui l'atteint On utilise soit un tube photomultiplicateur, soit un photodiode Système de mesure du courant amplifié : un galvanomètre un système informatique de traitement des données < number > Appareillages : Néphélémètre : Source lumineuse : laser Un rayon lumineux est rendu monochromatique par l'interposition d'un filtre, ou d'un monochromateur Le rayon lumineux est réfléchi à 90° par un miroir qui l'envoie sur la cuve qui contient l'échantillon < number > Laser Précision Calibration : Types de diffusion < number > Appareillages : Néphélémètre : La lumière diffusée dans toutes les directions est réfléchie plusieurs fois par un miroir sphérique qui envoie quasiment la totalité de la lumière diffusée vers le détecteur qui est relié a un système de traitement de signale obtenu < number > Mise en œuvre : Les particules en suspension : doivent avoir un volume moyen constant se trouver en milieu homogène pour cela il faut contrôler : La température La concentration des réactif La concentration de l'échantillon (dilutions) La vitesse avec laquelle ils se mélangent < number > Mise en œuvre : Parfois on ajoute au milieu des substances protectrices qui augmentent la viscosité et maintiennent la suspension stable (polyéthylène glycol) Les mesures ne sont valables que dans certaines limites de concentration Il se produit le même effet de filtre interne que pour les mesures de fluorescence Le solvant doit être non absorbant La longueur d'onde incidente doit être choisie avec soin < number > Applications en biologie clinique : Dosages des protéines spécifiques du sérum et du plasma : Marqueurs de l‘état immunitaire (IgG, IgA, IgM, chaines légères liées kappa et lambda, fractions du complément C3 et C4, β2-microglobuline, complexes immuns . [...]