Synthèses et tests de supports polymères pour Chromatographie Liquide à Haute Performance (HPLC)

Résumé du document

L'objectif de ce document est de mettre au point et de tester un nouveau support polymère. Actuellement, en chromatographie liquide, les supports couramment utilisés sont en silice et, ils ne peuvent être utilisés aux pH extrêmes acides ou basiques. En ce qui concerne les polymères, ils présentent les avantages d'être des supports résistants à la pression, la taille des particules ainsi que leur régularité peuvent être maîtrisées, c'est-à-dire que leurs structures sont homogènes, leurs fabrication sont reproductibles et ils présentent une grande stabilité en fonction du pH de 0 à 14.
Notre objectif est donc, dans un premier temps, de synthétiser des particules polymères fonctionnalisées par des groupements époxy, puis dans un second temps, de remplir une colonne, de procéder au greffage de la protéine et enfin, de tester ces colonnes en HPLC.
C'est pourquoi, je traiterai dans une première partie de la synthèse des particules polymères, puis dans une seconde partie, de la réalisation de la colonne. Nous verrons ensuite le greffage de la protéine sur la colonne et, pour conclure, nous verrons les tests réalisés sur ces colonnes.

Extraits

[...] L'étape de synthèse du polymère nous a permis de montrer l'importance de l'agitation au cours de la formation du polymère. En effet, dès que l'agitation n'est pas assez lente, il y a automatiquement formation d'agrégats. Mis à part ce point crucial, nous pouvons dire que globalement, la synthèse de polymères par ce type de procédé est relativement aisée. D'autre part, la caractérisation au microscope optique, nous a permis de voir la bonne isométrie de nos particules, ce qui laisse présager une bonne efficacité en séparation chromatographique, pour l'utilisation des particules en tant que support pour HPLC. [...]

[...] En ce qui nous concerne, la durée de greffage de la protéine est d'environ 24h. Afin de déterminer la quantité de protéine greffée, plusieurs lavages sont effectués à la suite du greffage. La concentration en protéine des solutions de lavage est alors déterminée par absorption UV à la même longueur d'onde. Par différence avec la solution de greffage de départ, on obtient la quantité de protéine effectivement greffée. Le mode opératoire du greffage, le montage utilisé ainsi que le calcul du taux de greffage sont donnés respectivement en Annexe 3.III/2, 3.III/3 et 3.IV. [...]

[...] l'intérieure des particules n'est pas accessible). En effet, si nous laissons agiter longtemps sans ajout d'acide, la solution redevient bleu-violet. Mécanisme du dosage : Dans un premier temps, l'acide perchlorique réagit avec le bromure de tétraéthyle ammonium pour former de l'acide bromhydrique selon l'équation suivante : L'acide bromhydrique conduit ensuite à l'ouverture du cycle de l'époxy, comme tel : Lorsque le volume de HClO4 versé est supérieur au volume équivalent, la solution voit son pH diminuer car il y a accumulation d'acide bromique. [...]

[...] I.2.b- Réactions mises en jeu : Le mécanisme mis en jeu pour cette synthèse est celui d'une polymérisation en chaîne. Dans ce type de réaction il y a attaque d'un centre actif sur une insaturation du monomère. Dans le cas présent, le monomère présente une insaturation vinylique, les centres actifs sont des radicaux libres : nous sommes donc dans le cas d'une polymérisation radicalaire. [ Voici le mécanisme pour le monomère divinylbenzène. Etape 1 : Formation des radicaux libres. Au cours de cette synthèse, l'amorceur utilisé est l'AIBN (azobisisobutyronitrile). Sous l'action de la chaleur, deux radicaux libres sont générés. [...]

[...] D'après les photos obtenues (cf. Annexe 3.V.), nous pouvons dire que, pour les protéines greffées avant lavage, elles ont été adsorbées à la surface des particules. Après trois lavages par ultracentrifugation, nous observons l'élimination de la quantité de protéines adsorbées une légère modification de surface des particules par comparaison avec les particules de base. Globalement, il est difficile de tirer des conclusions uniquement à partir des photos du MEB, mais nous pouvons retenir que : à l'origine, les particules sont hydrophobes, c'est pour cela que nous utilisons les ultrasons afin de les solubiliser. [...]