Caractéristiques cinétiques de la phosphatase acide

Résumé du document

La phosphatase acide est un enzyme qui catalyse l'hydrolyse des monoesters phosphoriques en libérant du phosphate inorganique.
Nous l'étudierons à l'aide d'un substrat artificiel, le para-nitrophénylphosphate (NPP).
Le degré d'hydrolyse est déterminé en mesurant la quantité de p-nitrophénol libéré par la réaction.

Extraits

[...] Caractéristiques cinétiques de la phosphatase acide 1. Introduction La phosphatase acide est un enzyme qui catalyse l'hydrolyse des monoesters phosphoriques en libérant du phosphate inorganique. Nous l'étudierons à l'aide d'un substrat artificiel, le para- nitrophénylphosphate (NPP). Le degré d'hydrolyse est déterminé en mesurant la quantité de p-nitrophénol libéré par la réaction. L'activité de l'enzyme dépend du pH, de la température et de sa concentration. Les phosphatases acides sont présentes dans de nombreux organes, à des niveaux subcellulaires variés (cytoplasme, lysosomes). [...]

[...] Nous avons dès lors cherché la cause de ces erreurs sans succès Mise en évidence d'un effet d'inhibition Objectif : déterminer le genre d'inhibiteur auquel on a affaire Mode opératoire Dans cinq tubes à essai : - 0,05 ; 0,1 ; 0,2 ; 0,5 ; 1 ml de substrat NPP (0,025M) - 2ml de tampon phosphate pH 4,8. - Porter le volume à 4,5 ml en ajoutant de l'eau. Placer ces tubes dans un bain d'eau à 37°C pendant quelques minutes max). [...]

[...] - Partie 3 : déterminer la constante de Michaëlis pour le nitrophénylphosphate et la vitesse maximale. - Partie 4 : mise en évidence d'un effet d'inhibition Détermination de la dilution optimale de l'enzyme Objectif : Avoir une vitesse constante pendant la période de mesure (environ 30 minutes) Mode opératoire Nous avons mesuré l'absorbance au cours du temps de la solution-mère d'enzyme ainsi que de deux dilutions (10x et 100x). Pour chaque dilution : Dans un tube à essais : - 2ml de substrat NPP mM). [...]

[...] Interprétation des résultats. Nous remarquons en observant le graphique que la courbe de la solution mère augmente trop rapidement et que les valeurs d'absorbance ne sont plus valables pour Beer-Lambert. La solution diluée 100x, elle, réagit beaucoup trop lentement et ne peut être retenue à cause d'un manque de précision. Par contre la dilution 10x semble être optimale car elle nous donne une droite presque parfaitement linéaire faite de valeurs qui satisfont la loi de Beer-Lambert. C'est pourquoi, pour la suite des manipulations, nous utiliserons la dilution 10x Détermination du pH optimal Objectif : Mesurer la vitesse de réaction de l'enzyme à 8 valeurs de pH : 3 ; 4 ; 4,5 ; 5 ; 5,5 ; 6 ; 7 ; Mode opératoire Nous utiliserons donc la dilution 10x Dans 8 tubes à essais : - 2ml de substrat NPP mM). [...]

[...] On peut déduire de ce graphe les valeurs de 1/Vmax et -1/Km Si y = 0 X = -3,724 et donc Km = 0,268 Si x = 0 Y = 182,7 et donc Vmax = Remarque : Nous pouvons remettre en cause la fiabilité de nos résultats au vu du coefficient de détermination qui est égal à 0,777. Nous avons dès lors cherché la cause de ces erreurs sans succès. Néanmoins, étant donné que Vmax diminue et que Km augmente, nous sommes en présence d'une inhibition incompétitive. Un inhibiteur incompétitif ne se lie sur l'enzyme qu'après fixation du substrat et empêche la formation des produits. [...]