Electrophorèse et techniques de visualisation

Résumé du document

L'électrophorèse est une technique permettant la séparation des macromolécules en fonction de leur taille, de leur charge ainsi que d'autres propriétés physiques. L'énergie motrice de l'électrophorèse est un champ électrique appliqué par des électrodes de part et d'autre d'un support.

Les protéines possèdent des groupes ionisables, soit positivement soit négativement, à pH donné. Selon la nature de la charge, les particules migreront vers l'une ou l'autre électrode (...)

Extraits

[...] Ensuite, on procèdera à trois lavages de 20 minutes dans de l'eau mQ avant de placer en incubation dans une solution à 34% méthanol acide phosphorique et 17% sulfate d'ammonium dans laquelle on ajoutera 360mg de G250 par litre. L'agitation s'étendra durant 1 à 4 jours. Laver le gel à l'eau pour éliminer les reliquats de G-250. Il est désormais prêt à être scanné. SYPRO La coloration au SYPRO est une coloration souvent utilisée en lecture de gel 1-D PAGE. Toutefois, la coloration n'est pas visible à l'œil nu et nécessite un scanner à fluorescence. Sa limite de détection est comprise entre 0.25 et 1ng et sa linéarité s'étend jusqu'à 1µg. [...]

[...] C'est cette force qui caractérise le mouvement de la molécule d'une électrode vers l'autre. Opposée à cette force, existe une résistance de friction ralentissant le mouvement. Celle-ci est dépendante de la taille hydrodynamique de la molécule, la forme de la molécule, la taille des pores du gel et de la viscosité du tampon. La vitesse d'une molécule chargée est fonction du gradient de potentiel, de la charge et des forces de frictions. Elle est exprimée par : Ou f est le coefficient de friction. [...]

[...] De plus, le courant passant au travers du gel est conduit par les ions du tampon mais également par les ions de l'échantillon. La relation entre U et R s'exprime telle que dans la loi d'Ohm : Donc, pour une résistance R constante, il est possible d'augmenter la vitesse de séparation par augmentation de la tension ce qui engendrerais une augmentation du courant. Toutefois, cette augmentation du courant et de la tension provoquerait une augmentation de la température par effet joule : W = UI Cette augmentation de chaleur augmenterait l'effet de diffusion des échantillons provoquant l'élargissement des pics d'échantillons, la formation de courant de convection mélangeant les échantillons séparé ainsi que l'instabilité des échantillons thermosensible et une réduction de la résistance du milieu par diminution de la viscosité du tampon. [...]

[...] Méthode Après l'électrophorèse, le gel est placé dans un bain de fixation composé de 40% de méthanol acide acétique et 53% d'eau mQ. On peut réaliser deux bains d'une demi-heure ou bien laisser le gel dans la solution overnight. La prochaine étape est la coloration dans le SYPRO sur une durée variant de 5heures à une nuit. Ensuite, le gel doit être lavé dans une solution 10% méthanol acide acétique d'eau mQ. Trois lavages seront ensuite effectués à l'eau mQ pour retirer les dernières traces d'acide pouvant altérer le scanner. La lecture du gel demande une excitation pour permettre la fluorescence. [...]

[...] On a donc recours à des techniques permettant leur visualisation Bleu de Coomassie G250 La zone de linéarité de la coloration est comprise entre 10ng et 10µg. Principe Le colorant a des affinités pour les groupements NH2 libre et se fixe donc les groupes chargés positivement (Lysine, Arginine, Donc, les protéines chargées seront plus fortement colorées (les protéines basiques sont plus fortement colorées et les protéines acides ne peuvent pas être colorées). La décoloration se fait là où il n'y a pas de protéine. [...]