Mécanismes moléculaires de la virulence chez l. pneumophila

Résumé du document

Les bactéries du genre Legionella sont responsables de la légionellose, appelée aussi « maladie du Légionnaire », une maladie connue depuis l'épidémie de 1976 à Philadephie survenue chez des combattants de la Légion américaine (Fraser, 2005). Dans sa forme la plus aigüe, la légionellose conduit à une pneumonie grave qui, en l'absence d'un traitement antibiotique rapide (fluoroquinolones, macrolides), peut conduire au décès de 10 à 20% des patients, et plus particulièrement des patients âgés, immuno-déprimés, diabétiques ou tabagiques ou atteints d'affections respiratoires chroniques. En France, 1527 cas de légionellose sont survenus en 2005, dont 152 ayant entraînés le décès des patients. La forme bénigne de la légionellose est la fièvre de Pontiac, dont les symptômes s'apparentent à ceux de la grippe (Fields et al., 2000).
Les bactéries Legionella présentent un formidable potentiel adaptatif puisqu'elles sont présentent dans des environnements naturels présentant des caractéristiques physico-chimiques diverses, tels que les sols humides, l'eau des lacs et des rivières, mais également dans des habitats « artificiels » créent par l'homme tels que les canalisations de distribution d'eau potable, les douches, les spas, les climatisations... Ces bactéries sont présentes sous forme libre, mais sont aussi capables de se multiplier dans une très grande variété de protozoaires comme des amibes (Acanthamoeba, Dictyostelium, Hartmanella, Naegleria) et des ciliés (Tetrahymena) (Fields et al., 2002). La technologie humaine a créé des conditions favorables en faveur de l'exposition et la contamination éventuelle à l'homme. En effet, la transmission se fait par inhalation de micro-gouttelettes d'eau ou d'aérosols contaminés, et générés par exemple par les tours aéro-réfrigérantes, les climatisations, les humidificateurs d'air, les bains bouillonnants, les fontaines, les systèmes d'arrosage, etc. Dans ce cas, les bactéries infectent les macrophages présents dans les alvéoles pulmonaires, entraînant leur lyse puis celle des pneumocytes, créant ainsi une nécrose des tissus environnants et une inflammation. Le processus d'infection des macrophages est analogue à celui utilisé pour l'invasion des amibes. Il s'agit donc d'un cas incontestable d'introduction d'une bactérie pathogène dans la population humaine et d'émergence d'une nouvelle pathologie liée à la technologie humaine. Les traitements par des méthodes de nature thermique (70°C) ou chimique (chloration) sont efficaces à court terme, mais le succès de ces traitements n'empêche pas une recolonisation à moyen terme, résultant de la vie intracellulaire de Legionella dans les amibes ou sous forme de biofilms.
Ainsi, dans l'environnement, les bactéries Legionella présentent une forte diversité écologique et un spectre d'hôtes très large, mais toutes les espèces ne semblent pas pour autant pathogènes pour l'homme. En effet, parmi les 48 espèces de Legionella décrites à ce jour, l'espèce L. pneumophila est responsable de plus de 90 % des cas de légionellose en France, 96 % étant liés au sérogroupe 1 parmi les 15 que contient cette espèce (Doléans et al., 2004). Cette répartition clinique diffère fortement de la situation observée dans l'environnement, où L. pneumophila sérogroupe 1 ne représente que 28% des isolats. Les isolats majoritairement détectés dans l'environnement, et donc les plus fréquemment au contact de l'homme, correspondent aux autres sérogroupes de L. pneumophila (47 % des isolats), qui ne représentent que 3 % des cas cliniques. Cela pourrait refléter l'existence de facteurs de virulence spécifiques ou d'un avantage sélectif particulier. Ainsi, un des enjeux des recherches menées sur cette bactérie est de comprendre pourquoi certaines espèces sont plus virulentes et réussissent à se disséminer de façon dramatique dans la population. Ainsi, le sujet de stage qu'il m'a été confié s'intègre dans une thématique globale qui visent d'une part à caractériser la diversité des isolats environnementaux et cliniques de L. pneumophila, afin d'identifier des marqueurs potentiels de virulence, et d'autre part à identifier les mécanismes moléculaires et écologiques de l'émergence de la virulence.

Extraits

[...] DNA topology and the global control of bacterial gene expression: implications for the regulation of virulence gene expression Microbiology (1995) 141: 1271-1280. Fields, B. S. The molecular ecology of legionellae. Trends. Microbiol. (1996) 4:286–290. Fields B.S., Benson D.F. And Besser R.E. Legionella and Legionnaires' disease : 25 years of investigation. Clin Microbiol Rev (2002) 15 506-26. [...]

[...] Coli, la souche TOP10. Les transformants sont ensuite étalés sur boîte LB Agar + kanamycine + X-Gal + IPTG. Afin de vérifier la présence de l'insert délété pour ihfA ou hipB dans le plasmide PCR®II-TOPO®, on réalise des PCRs sur colonie, à l'aide des oligonucléotides M13 reverse et M13 forward (InvitrogenTM). On teste 6 clones par gène. Aux vues des résultats des PCR sur colonie, nous choisissons de lancer les cultures en milieu liquide sur les colonies et puisque les fragments obtenus mesurent 1400 pb. [...]

[...] Les isolats cliniques MV20 et MV36 et environnementaux MV23 et MV27 présentent chacun un profil unique. Aucun signal n'est obtenu pour les isolats MV et 12. La présence de 9 copies de l'IS4, indiquée par les outils bio- informatiques, pour la souche de référence MV7 est confirmée par son profil RFLP-IS, qui présente 9 bandes. Le nombre de copies de cette IS est très peu variable en fonction des isolats Conclusions Les profils RFLP-IS ont montré une répartition différente des IS en fonction des isolats testés. [...]

[...] D'autre part, l'Ac anti-DIG est également couplé à une phosphatase alcaline qui permettra ensuite la détection de cet Ac et donc de l'hybride ADN sonde ADN cible. Après les 30 minutes d'incubation, l'Ac anti-DIG est éliminé par des lavages successifs dans du tampon puis la membrane est incubée en présence de CSPD (Disodium 3-(4-methoxyspiro {l,2-dioxetane-3,2'-(5'- chloro)tricyclo[ ,7]decan}-4-yl) phenyl phosphate). Ce dernier est un substrat chimioluminescent de la phosphatase alcaline. Il sera donc coupé par cette enzyme au niveau de l'Ac anti-DIG. [...]

[...] Fliermans C.B., Cherry W.B., Orrison L.H., Smith S.J., Tison D.L. And Pope D.H. Ecological distribution of Legionella pneumophila. Appl Environ Microbiol (1981) 41 9-16. Fraser D.W. The challenges were legion. Lancet Infect Dis (2005) 5 : 237-41. Grant R.A., Filman D.J., Finkel S.E., Kolter R., Hogle J.M. The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA. Nat. Struct. [...]