Impact de l'oncoprotéine virale E6 d'HPV16 sur la régulation du clivage protéolytique de la cadhérine N par PPAR?

Thèmes abordés

PMV Papillomavirus, virus HPV-16, oncogènes du papillomavirus humain, cadhérine N, virus, cellules humaines, gènes, tumeur

Résumé du document

La cadhérine N, glycoprotéine transmembranaire impliquée dans la motilité cellulaire et l'invasion, est un marqueur de progression tumorale. Elle est le substrat d'un clivage protéolytique par la disintégrine métalloprotéase ADAM10 générant un fragment soluble extracellulaire NTF (N - Terminal Fragment) et laissant enchâsser dans la membrane plasmique un fragment CTF1 (C- Terminal Fragment 1). Ce dernier est alors clivé par le complexe de la ?-sécrétase libérant un fragment soluble CTF2 (C-Terminal Fragment 2) transloqué au noyau pour activer la transcription de gènes prolifératifs. Dans des cellules de cancer du col de l'utérus abritant le papillomavirus humain de type 16 (HPV16), nos résultats suggèrent que la ?-sécrétase n'est pas fonctionnelle et pourrait être réactivée par un activateur du récepteur nucléaire PPAR?, le GW501516. Cette réactivation pourrait être due à la diminution de l'expression des transcrits de l'oncogène e6 et des protéines virales E6 et E7, responsables de l'immortalisation et de la transformation des cellules infectées. La régulation négative du gène e6 impliquerait l'augmentation du facteur de transcription inhibiteur YY1 et la diminution des activateurs transcriptionnels cEBP? et SP1.

Extraits

[...] Dosage des ARN Les ARN ont été quantifiés par spectrophotométrie d'absorption à 260 nm à l'aide d'un NanoDrop. La contamination protéique a été évaluée par lecture de l'absorbance à 280 nm et la pureté jugée satisfaisante si le rapport des absorbances à 260 et 280 nm était compris entre 1,8 et 2. Rétro-Transcription La reverse transcription a été effectuée à l'aide du kit Maxima[TM] (Thermo Scientific). Afin d'éviter une éventuelle contamination des ARN par de l'ADN génomique, un traitement à la DNase I a été effectué. [...]

[...] Les échantillons ont ensuite été déposés sur une plaque de 96 puits avant d'être analysés grâce à l'appareil StepOnePlus(TM) (Applied Biosystems). Tableau II : Séquences des amorces sens et antisens utilisés en qPCR Cible de l'amorce Amorce sens Amorce antisens β2 - microglobuline GATGAGTATGCCTGCCGTGTG CAATCCAAATGCGGCATCT e6 all GAGAACTGCAATGTTTCAGGACC TGTATAGTTGTTTGCAGCTCTGTGC e6*I CTGCGACGTGAGGTGTATTA TGTCCAGGTGTCTTTGCTTT e6 fl CACAGGAGCGACCCAGAAA CCCGAAAAGCAAAGTCATATACC yy1 ACCTGGCATTGACCTCTCAG TTCTCATGGCCGAGTTATCC cebpβ TACTACGAGGCGGACTGCTT AGGTACGGGCTGAAGTCGAT sp1 AGTTCCAGACCGTTGATGGG GTTTGCACCTGGTATGATCTGT Étude de l'expression des protéines Extraction et dosage des échantillons protéiques Les protéines ont été extraites à partir d'un culot cellulaire, à l'aide de tampon de lyse RIPA (Tris - HCl 50 mM pH 7,4 ; NaCl 150 mM ; NP- ; désoxycholate de sodium ; EDTA 1 mM) contenant 25 μl/mL d'une solution d'inhibiteurs de protéases (Complete, Roche Diagnostics) et 5 uL de PMSF 0,2 M. [...]

[...] Par contre, dans les cellules CaSki en prolifération, la présence de DAPT augmente le taux de CTF1 des cellules traitées au GW501516 comparativement aux cellules stimulées par le GW501516 seul. Donc, le DAPT inhibe l'effet du GW501516. Ces observations renforcent l'idée que la présence de GW501516 augmenterait l'activité de la γ-sécrétase. A B Figure 7. Analyse par western-blotting de l'effet de différentes doses de GW501516 associées ou non au DAPT (inhibiteur de la γ-sécrétase) sur l'expression et le clivage de la cadhérine N. [...]

[...] 1992;358: 771-774. Péchery Fauconnet Bittard et al. Apoptotic effect of the selective PPARβ/δ agonist GW501516 in invasive bladder cancer cells. Tumour Biol. 2016;37:14789-14802. Thiery JP, Acloque Huang RYJ, et al. Epithelial-Mesenchymal Transitions in Development and Disease. Cell. 2009;139:871 - 890. Cavallaro Schaffhauser Christofori G. [...]

[...] Au niveau du génome viral, on retrouve des sites donneurs et des sites accepteurs (SA). Le site donneur d'épissage en position 226 (SD226), et le site accepteur d'épissage en position 409 (SA409) sont liés à l'expression de la protéine E6 Les transcrits viraux non épissés en SD226 et SA409 codent la protéine E6 entière (E6Fl). En revanche, l'utilisation concomitante du SD226 et du SA409 conduit à la production d'ARN codant la protéine E6*I L'intégration du génome viral circulaire au sein d'un chromosome de la cellule hôte se fait préférentiellement dans des régions de grande instabilité génomique appelées Common Fragile Sites (CFS) et suit un mécanisme précis où les gènes codant les protéines E6 et E7 sont toujours conservés et fonctionnels. [...]