Immunothérapie anti-tumorale par vaccin bactérien vivant

Résumé du document

Ce travail porte sur une approche vaccinale utilisant le système de sécrétion de type III (SSTT) de Pseudomonas aeruginosa pour vectoriser des protéines antigéniques. Le SSTT permet d'injecter des protéines directement dans le cytoplasme de cellules eucaryotes cibles. L'objectif est d'obtenir une présentation de l'antigène vaccinal via les molécules de CMH I en vue de déclencher une réponse T cytotoxique spécifique contre les cellules tumorales exprimant ce même antigène.
Le groupe BacVac a modifié génétiquement le SSTT de P. aeruginosa dévolu à l'injection de toxines pour qu'il puisse injecter des protéines antigéniques dans des cellules eucaryotes (brevet W02005/049644). Il a mis au point et prouvé l'efficacité de ce vecteur dans un modèle tumoral murin artificiel (mélanome B16-ovalbumine) en vaccinations prophylactique et thérapeutique (1).
Les résultats obtenus au sein du groupe Bac Vac ont principalement été obtenus avec ce modèle tumoral mélanome B16-ovalbumine exprimant artificiellement l'ovalbumine après transfection. Le schéma vaccinal prophylactique utilisé au sein du laboratoire est un schéma à deux injections qui ont lieu chacune 14 jours et 7 jours avant le challenge tumoral. L'objectif de ce travail est d'optimiser le schéma vaccinal prophylactique en modèle tumoral murin artificiel B16-ovalbumine, de concevoir des vecteurs bactériens sécrétant des protéines endogènes du glioblastome GL26, et de les tester dans ce modèle tumoral naturel.

Extraits

[...] Ces résultats ont pu être mis en évidence avec la souche vaccinale OA-OVA pour une dose cumulée totale de 107 bactéries. Nous ne disposons pas de comparaison de ces schémas avec OAL- OVA pour une dose cumulée totale identique. D'autre part, les résultats obtenus avec OAL-OVA et OA-OVA ne montrent pas de différence significative de survie entre le schéma 5 jours x 2 injections/j et le schéma 5 jours x 2 injections/j dans lequel les vaccinations sont réalisées du côté droit et du côté gauche de la souris. [...]

[...] 36) Préparation du vaccin Les bactéries sont mises en culture la veille en milieu liquide à partir d'une bille du souchier. Elles sont lavées et mises en culture à la DO de 0,2 en présence d'IPTG. Quand la DO est comprise entre 1,3 et les bactéries sont lavées puis reprises avec du tampon PBS pour obtenir la concentration bactérienne désirée. Chaque dose vaccinale fait 100 µL et est exprimée en nombres de bactéries Biologie moléculaire 37) Extraction de l'ADN plasmidique Elle est réalisée grâce au kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen®) selon les instructions du fabriquant. [...]

[...] - le mutant CHA-OST-AroA dérive de la souche CHA-OST par délétion du gène aroA . Ce gène code pour l'enzyme phosphoshikimate carboxyvinyltransférase nécessaire à la synthèse du chorismate, précurseur commun des acides aminés aromatiques : il s'agit d'une souche auxotrophe. - le mutant CHA-OST-AroA-LasI (OAL) dérive de la souche CHA-OST-AroA par délétion du gène LasI, molécule du Quorum Sensing , systéme de signalisation permettant la coordination inter-bactérienne . Les souches d'Escherichia coli Les souches utilisées sont des bactéries commerciales supercompétentes (DH5 alpha, XL1-Blue (Stratagene®)). [...]

[...] Dans notre cas, la mutagénèse dirigée sert à modifier un épitope murin de la séquence antigénique murine gp100 en son homologue humain (hgp100). Amorce human gp100 sens : ggctgctcgtcgacctaaaggtgccgaagaatcaggactggct Amorce human gp100 antisens: agccagtcctgattcctcggcacctttaggtcgacgagcagcc Les transformants sont sélectionnés sur gélose LB ampicilline. Les colonies sont repiquées dans 1,5ml de LB ampicilline liquide dont on extrait l'ADN plasmidique. Le séquençage des plasmides est réalisée par la société allemande AGOWA. Si le résultat des séquences est correct, les plasmides extraits de E.Coli sont utilisés pour transformer P.aeruginosa par électroporation. [...]

[...] Feb J.Steitz et al., Genetic immunization of mice with human tyrosinase- related protein2: implications for the immunotherapy of melanoma. [...]