Thérapie génique : définitions, principes, etc.

Résumé du document

- Premier concept de thérapie évoqué par la communauté scientifique à la fin des années 60 (acceptable théoriquement, mais irréalisable technologiquement).
- Premiers essais réalisés dans les années 80 avec promesse de beaucoup d'espoirs, surtout pour ceux présentant des maladies génétiques.
- Premier désenchantement aussi :
* des années de tâtonnements et d'échecs.
* un nombre très limité de patients ayant tiré un bénéfice réel.
- (...)

Extraits

[...] : Inconvénient : ARNm du gène présent seulement lors de sa transcription et seulement en cas de besoin de l'organisme Avantages : enzymes de restriction non nécessaires introns ne posant plus de problème (absence de leurs parties correspondantes sur ARNm mature) 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > Principe et étapes de la thérapie génique Localisation du gène Isolement et clonage Transfert du gène ou production de la protéine thérapeutique Vérification de l'intensité et la durée de l'expression du gène thérapeutique ainsi que les éventuels effets secondaires 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry Isolement et clonage Isoler et purifier l'ARNm localisé Produire l'ADN du gène correspondant à l'ARNm en utilisant une transcriptase inverse des rétrovirus Insérer ce gène à un seul endroit dans des plasmides bactériens (utilisation d'une enzyme de restriction) pour faire des copies de ce gène* * plasmides : petites molécules d'ADN circulaires capables d'autoréplication, fonctionnant de façon indépendante de la cellule porteuse, aptitude de « sauter » d'une cellule à une autre) 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > Isolement et clonage Mettre en culture la bactérie dans les meilleures conditions : 1 bactérie :  23 ou 8 bactéries en une heure si division toutes les 20 mn  23x24 ou milliards de milliards de bactéries en 24 heures * plasmides : petites molécules d'ADN circulaires capables d'autoréplication, fonctionnant de façon indépendante de la cellule porteuse, aptitude de « sauter » d'une cellule à une autre) 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > Principe et étapes de la thérapie génique Localisation du gène Isolement et clonage Transfert du gène ou production de la protéine thérapeutique Vérification de l'intensité et la durée de l'expression du gène thérapeutique ainsi que les éventuels effets secondaires 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry Transfert du gène ou production de la protéine thérapeutique Transfert du gène Production de la protéine thérapeutique 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry Transfert du gène Thérapie génique in vivo Thérapie génique ex vivo Utilisation de vecteurs 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry Thérapie génique in vivo Gène médicament directement apporté par : injection au sein de l'organe ou du tissu malade voie sanguine pour des cibles tissulaires de volume important 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry Transfert du gène Thérapie génique in vivo Thérapie génique ex vivo Utilisation de vecteurs 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry Thérapie génique ex vivo Autogreffe avec cellule(s) corrigées génétiquement Réalisation si accès possible aux cellules malades Étapes : prélever la cellule malade insérer le gène absent ou remplacer le gène malade (guérir directement la cellule) réimplanter la cellule avec le génome corrigé (autogreffe) 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > Exemples : maladies sanguines : cellules sanguines faciles à prélever et à réintroduire in situ (vecteur de transfert directement injecté dans la circulation sanguine et devant atteindre spécifiquement les cellules cibles) mucoviscidose : prélèvement de cellules de la moelle, correction puis réimplantation dans la moelle osseuse tumeur : possibilité d'utilisation de gènes-suicide pour la destruction sélective de cellules tumorales Thérapie génique ex vivo 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > Transfert du gène Thérapie génique in vivo Autogreffe avec cellule(s) corrigées génétiquement ou thérapie génique ex vivo Utilisation de vecteurs 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry Utilisation de vecteurs Réalisation si accès difficile aux cellules malades : Caractéristiques d'un vecteur : aptitude à compacter les acides nucléiques du gène (plusieurs milliers de paires de bases d'ADN, occupant en solution un volume comparable à celui d'une cellule) capacité de protéger le gène thérapeutique de la destruction provoquée par les agents physiques et biologiques (enzymes) actifs dans le milieu 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > Utilisation de vecteurs Caractéristiques d'un vecteur (suite) : franchissement des différentes membranes de la cellule cheminement efficace du gène jusqu'au noyau aptitude à faire demeurer le gène thérapeutique à l'endroit d'insertion une fois arrivé au noyau afin de conférer une modification permanente 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > Utilisation de vecteurs Vecteurs viraux Vecteurs non viraux 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > Vecteurs viraux Choix des vecteurs viraux Production de vecteurs viraux 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > Choix des vecteurs viraux Choix du virus motivé par ses caractéristiques et propriétés : reconnaissance à la surface cellulaire de récepteurs leur servant de porte d'entrée parasitisme cellulaire détournement du métabolisme cellulaire à son profit reprogrammation de la cellule hôte par transfert de gène élaboration au cours de leur évolution de stratégies d'une efficacité et d'une variété étonnante 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > Choix des vecteurs viraux Virus sélectionnés : Adénovirus : Intégration directe de son matériel génétique dans la cellule cible, sans attendre la mitose (division cellulaire) Taux de multiplication important Non possession d'éléments leur permettant de maintenir leur génome de manière continue dans la cellule infectée Difficulté pour le moment de se débarrasser complètement de son caractère pathogène 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > Choix des vecteurs viraux Virus sélectionnés (suite) : Rétrovirus : Infection latente avec stabilisation génome durant cette période Pénétration du génome dans le noyau cellulaire avec disponibilité d'une enzyme (intégrase) capable d'insérer l'ADN dans la continuité du génome de l'hôte et assurant ainsi sa pérennité 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > Choix des vecteurs viraux Virus sélectionnés (suite) : Virus adéno-associés ou AAV : Vecteurs dérivés des adénovirus Particularité : intégration toujours au même endroit dans un chromosome* * Point extrêmement important en thérapie génique, car une insertion non contrôlée risque d'entraîner d'importants désordres dans la fonction cellulaire) 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > Vecteurs viraux Choix des vecteurs viraux Production de vecteurs viraux 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > Production de vecteurs viraux Utilisation de la même capside virale : Séquences codant pour les protéines virales séparées de celles servant d'éléments régulateurs pour la réplication et l'expression des gènes viraux Introduction de ces séquences dans des cellules en culture Production par ces cellules de capsides vides, dépourvues de génome viral : «cellules d'empaquetage») 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > Production de vecteurs viraux Utilisation de génome viral modifié : Autres séquences du génome viral utilisées pour construire un génome recombinant avec insertion du gène thérapeutique (iii) Introduction du génome recombinant dans les cellules d'empaquetage 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > Thérapie génique production de vecteurs viraux 05/11/1911:22 < number > Vecteurs viraux N.B. [...]

[...] 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry PLAN Introduction Rappels Définitions et cadrage de la thérapie génique Objectif - principe et étapes de la thérapie génique Résultats Perspectives Conclusion 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry Objectif - principe et étapes de la thérapie génique Objectif Principe Etapes de la thérapie génique 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > Objectif Implication de trois éléments principaux : Gène Vecteur : moyen utilisé pour transférer une information génétique au sein des cellules visées Cellule cible 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > Objectif - principe et étapes de la thérapie génique Objectif Principe Etapes de la thérapie génique 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry Principe Identifier le gène déficient Trouver un gène sain et/ou empêcher la synthèse de la protéine néfaste : dans le génome d'un individu sain dans le génome d'une autre espèce dans le futur, le créer artificiellement 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > Principe Trouver un moyen pour l'intégrer dans le génome de la cellule cible et le faire exprimer Suivre la destinée du gène intégré : acceptation ou rejet par le génome de l'hôte 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > Principe Difficultés dans la mise en pratique liées au système de protection mis en place par l'organisme au cours des millions d'années de son évolution pour se protéger de l'environnement, en particulier à résister à toute tentative d'introduction d'ADN étranger dans son génome Conséquences : originalité de chaque tentative de transfert du triade gène-vecteur-cellule cible 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > Objectif - principe et étapes de la thérapie génique Objectif Principe Etapes de la thérapie génique 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry Etapes de la thérapie génique Localisation du gène Isolement et clonage Transfert du gène ou production de la protéine thérapeutique Vérification de l'intensité et la durée de l'expression du gène thérapeutique ainsi que les éventuels effets secondaires 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry Localisation du gène Approche logique  remonter de la protéine jusqu'au gène Identifier les premiers acides aminés rentrant dans la structure primaire de la protéine Retrouver les codons correspondants à ces premiers acides aminés en utilisant le code génétique* Utiliser ces premiers codons du gène ciblé pour le trouver dans le génome de l'organisme donneur * Un acide aminé pouvant avoir plusieurs codons correspondants ; exemple leucine avec six formes différentes de codons UUA; UUG; CUU; CUC; CUA ou CUG) 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > Localisation du gène Retrouver le gène dans tous les chromosomes d'une cellule Rechercher l'ARNm dans la cellule productrice 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry Retrouver le gène dans tous les chromosomes d'une cellule Couper au préalable les ADN en utilisant des enzymes de restriction (manque de précision) Mettre en contact les fragments d'ADN avec la (les) sonde(s) radioactive(s) (fragment constitué par les premiers codons du gène et rendu radioactif) Identifier le(s) fragment(s) radioactif(s) après migration électrophorétique et mise en contact avec une feuille photographique 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > Retrouver le gène dans tous les chromosomes d'une cellule N.B. [...]

[...] Elle fait partie des premières maladies héréditaires dont le gène a été identifié en 1993. [...]

[...] 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > Principe et étapes de la thérapie génique Localisation du gène Isolement et clonage Transfert du gène ou production de la protéine thérapeutique Vérification de l'intensité et la durée de l'expression du gène thérapeutique ainsi que les éventuels effets secondaires 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry Vérification de l'intensité et la durée de l'expression du gène thérapeutique ainsi que les éventuels effets secondaires Suivre le malade cliniquement et biologiquement Noter la moindre apparition d'effets indésirables (pharmacovigilance) 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > PLAN Introduction Objectifs Rappels Définitions et cadrage de la thérapie génique Objectif - principe et étapes de la thérapie génique Résultats Perspectives Conclusion 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry Résultats Résultats Résultats Fin des années 1960 : premier concept théorique de thérapie évoqué par la communauté scientifique (irréalisable technologiquement) 1975 : naissance du concept pratique avec l'émergence de la biologie moléculaire 1980 : première tentative d'introduction du gène fonctionnel de l'hémoglobine par Martin Cline de l'Université de Californie à Los Angeles sur deux patients atteints de thalassémie Béta-zéro 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry Résultats 1990 : premier essai tenté par trois chercheurs américains (Steven Rosenberg, French Anderson et Michael Blaese) de thérapie génique (greffe de LT porteur de gène thérapeutique) sur une petite Américaine de quatre ans présentant une maladie génétique liée à l'absence d'enzyme adénosine transaminase, provoquant un effondrement total de ses défenses immunitaires 1995 : nombre d'essais cliniques ayant reçu un avis favorable par la FDA aux USA en augmentation, allant de 49 protocoles cliniques anticancéreux en 1995 àr 168 en 1998 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry Résultats 1999 : cas d'un jeune américain de 18 ans souffrant d'une déficience en ornithine transcarbamylase, enzyme impliquée dans les chaînes de réaction du foie, porté volontaire pour un traitement par thérapie génique de transfert du gène OTC par adénovirus (decès suite à une forte réaction infllammatoire  coup d'arrêt pour de nombreux protocoles ) 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry Résultats 1999 : premiers résultats positifs de la thérapie génique par l'équipe du Pr Alain Fisher (France) sur des « bébés-bulles » atteints d'une grave maladie génétique (DICS-X) les privant de toutes défenses immunitaires (deux ans plus tard, ils mènent une vie normale) Suite : nombreux essais en cours (phase résultats encourageants obtenus pour l'hémophilie, la myopathie de Duchenne Existence également de nombreux essais sur le cancer 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry Résultats 2009 : annonce du premier succès d'un essai de thérapie génique d'une maladie neurologique mortelle - l'adrénoleucodystrophie* - par l'Inserm et l'Université Paris Descartes sur deux enfants traités par thérapie génique ans après le traitement, arrêt de la progression de la maladie sans effets secondaires) Aujourd'hui, plus de 3000 patients, majoritairement atteint de cancer, faisant partie d'essais cliniques en thérapie génique * L'adrénoleucodystrophie est la plus fréquente des leucodystrophies pour naissances). [...]

[...] : Vecteurs contenant des polymères (à la place des lipides) rendus plus spécifiques en leur fixant des ligands reconnaissant les protéines de surface de la cellule 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > Vecteurs non viraux Liposome Méthodes physiques 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > Méthodes physiques Microinjection : Injection de l'ADN thérapeutique dans le noyau de la cellule a l'aide d'une minuscule pipette Réalisation à la main avec un amplificateur de mouvement et un microscope Nécessité d'expérience et d'expertise pour la réussite 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > Méthodes physiques Injection sans aiguille : Utilisation de : un liquide à haute pression pour faire pénétrer l'ADN dans les espaces interstitiels un courant d'hélium à haute pression pour faire pénétrer l'ADN fixé sur des particules d'or directement dans le cytoplasme de la cellule 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > Méthodes physiques Electroporation * : ADN plasmidique injecté dans le tissu cible (par exemple le muscle de la patte d'une souris) Application par la suite de deux plaques d'acier contre la patte (servant d'électrodes) Envoi d'impulsions électriques répétées, en essayant de trouver les fréquences et intensités correspondant au meilleur transfert * Méthode permettant une transduction 100 fois plus efficace qu'une simple injection car e rendant la paroi momentanément poreuse et semblant "attirer" l'ADN vers l'intérieur de la cellule avec possibilités d'utilisation pour insérer le transgène dans le chromosome de cellules souches, permettant ainsi une expression durable 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > Transfert du gène ou production de la protéine thérapeutique Transfert du gène Production de la protéine thérapeutique 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry Production de la protéine thérapeutique Se servir de nos colonies bactériennes avec les plasmides modifiées (gène de la protéine manquante inséré à un même endroit avec utilisation d'une même enzyme de restriction) Utiliser les gènes régulateurs bactériens (promoteur, site initiateur et site terminateur de plasmide) utilisés comme repères par ARN polymérase ADN dépendante bactérienne Faire produire la protéine par les colonies bactériennes avec les plasmides modifiées 05/11/1911:22 < number > Professeur RASAMINDRAKOTROKA Andry < number > Production de la protéine thérapeutique Isoler et purifier la protéine thérapeutique (protéine thérapeutique encore mélangée avec les différentes protéines bactérienne) Exemples : Production d'insuline Production de facteurs antihémophilie A et/ou B . [...]