L'ingénierie des protéines

Résumé du document

On commence par un broyage mécanique des cellules en conditions dénaturantes, on sédimente ensuite les débris (apparition de deux phases dans le culot) on peut extraire l'ADN du surnageant (phase se trouvant au-dessus) par du phénol et du chloroforme. On précipite l'acide nucléique, que l'on re-dissout dans un culot d'eau stérile. Enfin, la dernière étape consiste à purifier l'ARNm par extraction sur une colonne d'oligo DT (...)

Extraits

[...] II.Les différentes étapes selon l'ADN choisi L'ADN cible peut être procaryote (on parle dans ce cas d'ADN génomique) ou bien eucaryote (on doit dans ce cas passer par l'état d'ARNm (messager) puis ADNc (complémentaire)). A. La préparation de l'ADN cible procaryote On débute avec une culture fraîche à 37°C puis on effectue un culot cellulaire par centrifugation. Les lysozymes sont ajoutées pour digérer la paroi nucléaire ainsi que des protéases K et des Rnases. On extrait les protéines (l'ajout de phénol et de chloroformes aide à créer deux couches dans le culot: une phase organique au fond du culot et une phase aqueuse au-dessus qui contient l'ADN à extraire). [...]

[...] C'est une méthode douce car l'ADN est fragile. B. La préparation de l'ADNm eucaryote ATTENTION : il faut vérifier au préalable que la protéine choisie soit bien induite! On commence par un broyage mécanique des cellules en conditions dénaturantes, on sédimente ensuite les débris (apparition de deux phases dans le culot) on peut extraire l'ADN du surnageant (phase se trouvant au- dessus) par du phénol et du chloroforme. On précipite l'acide nucléique, que l'on re-dissout dans un culot d'eau stérile. [...]

[...] (organisme hôte) + (vecteur d'expression) = Protéine recombinante IV. La levure 2μ ou plasmide navette Les plasmides sont des molécules d'ADN qui se répliquent de manière autonome et qui ne codent pas pour une fonction vitale. Le plasmide 2mu ne se trouve pas, comme la majorité des plasmides, dans une bactérie, mais dans la levure de boulanger. Sa structure linéaire est la suivante : promoteur de levure + ORI 2mu +marqueur + MCS MCS est le gène de résistance aux antibiotiques, c'est un marqueur d'autotrophie (les hôtes sont obligatoirement des levures mutées). [...]

[...] Comment accéder à la séquence de la phase ouverte de lecture qui nous intéresse ? 3 stratégies existent : Si la séquence de l'ADN est connue : On fait une PCR (que l'ADN soit génomique ou complémentaire), on amplifie la phase ouverte avec les oligo- nucléotides puis on ajoute sur le côté du brin des bases contenant des sites de restriction. Si la séquence est partiellement connue : on tente de calculer le pourcentage d'homologie avec une protéine connue, en connaissant la partie N-terminale par exemple (on compare avec les banques de données existantes). [...]