Méthodes d'exploration des cellules (PCEM1)

Résumé du document

Cellule :
- Unité vivante soit isolée, soit associée : organismes supérieurs.
- Petite taille : microscopie photonique ou électronique.
- Entité limitée par une membrane externe = membrane plasmique.
- Comporte des compartiments internes :
- Système endomembranaire : réticulum, noyau
(...)

Extraits

[...] Autres organites : mitochondries, lysosomes, peroxisosomes, vésicules. Comporte un squelette interne (cytosquelette). Peut ou non posséder : Des éléments externes mobiles (cil et flagelle). Des excroissances permanentes ou non (microvillosités, pseudopodes). Les cellules sont très complexes et leur ultrastructure est bien organisée. Fonctions et vie cellulaires Grandes fonctions cellulaires : Production d'énergie. Mouvement cellulaire et contact avec l'extérieur. Usine chimique : fabrication et destruction de molécules, recyclage. Trafic intracellulaire et avec l'extérieur. Communication : Coordination avec les autres cellules. Réponse aux stimuli. [...]

[...] Enregistrement par caméra et numérisation de cellules vivantes introduction de fluorescence (On ne peut pas colorer une cellule vivante, mais on peut la rendre fluorescente). Utilisée pour reconstruire des images en 3D (maintenant : confocal) ou pour suivre les mouvements intra-cellulaires (cellules vivantes). III] Isolement et culture des cellules Isolement à partir d'un tissu Digestion protéique à l'aide d'une protéase pour dissocier les cellules de la matrice et entre elles. Séparation des populations entre elles : Centrifugation. Attachement au plastique (pour les cellules qui adhèrent spontanément à la MEC. Ex : macrophages). [...]

[...] Le laser dilate l'adhésif qui se colle à la préparation (donc à quelques cellules). On retire ensuite l'adhésif avec les cellules qui s'y sont fixées. IV] Exploration moléculaire Fractionnement subcellulaire (séparation des organites) par ultracentrifugation Centrifugation à très haute vitesse (ultracentrifugation). Sépare les différentes structures suivant leur densité. Techniques d'analyse de l'ADN, des ARN et des protéines Etapes : Première étape : électrophorèse puis coloration. Deuxième étape : transfert sur un filtre de nitrocellulose par capillarité. Troisième étape : hybridation avec un marqueur spécifique (radioactivité, fluorescence). [...]

[...] On utilise une protéine de fusion (avec GFP) et un laser qui nettoie une zone de fluorescence (trop de lumière désactive la fluorescence) puis on regarde l'évolution. Electrophysiologie cellulaire Mesure de l'activité des canaux ioniques membranaires par patch-clamp. Étude des flux ioniques intracellulaires par sondes fluorescentes que l'on peut introduire dans des cellules vivantes (plus il y a d'atomes de calcium fixés sur la sonde au maximum, plus elle est fluorescente). Mesure du pH intracellulaire. VI] Conclusion La biologie cellulaire est une discipline expérimentale. Expérimentations multiples avec des résultats complémentaires. Évolution rapide des techniques et des connaissances avec complexification. Pas de dogme. [...]

[...] Sur des cellules entières. Sur des chromosomes étalés. Très utilisé en génétique médicale. Etude des cellules vivantes Protéines chimère fluorescentes GFP = Green Fluorescent Protein = protéine fluorescente verte d'un petit poisson dont on connaît la séquence génétique. Construction d'un gène chimère codant pour la protéine d'intérêt λ + GFP. Introduction dans la cellule (surtout dans le noyau) Transcription en ARNm codant pour le gène H et GFP (chimèrique). Production d'une protéine H-GFP. Visualisation (localisation, trafic) grâce à la GFP. [...]