FISH Hybridation Fluorescente In Situ, Diagnostic Constitutionnel Post-natal, Diagnostic Post-natal, Cytogénétique Hemato-oncologique, cytogénétique, ACPA Analyse Chromosomique sur Puce à ADN, hybridation, microdissection chromosomique, Hybridation fluorescente in situ, FISH Fluorescent In Situ Hybridization
Le document présente un cours sur la cytogénétique moléculaire dont les objectifs sont de reconnaître le principe et les indications de la technique FISH et de savoir le principe général et l'apport de la technique d'analyse chromosomique sur puce à ADN (ACPA) dans la détection des microremaniements chromosomiques.
[...] Les lavages sont adaptés en fonction de la nature la sonde. La Fluorescence Spectres de la Fluorescéine La molécule de Fluorescéine réémet de la lumière verte dont la longueur d'onde avoisine 525nm absorption émission molécule de La Fluorescéine est excitée 60 avec50le plus d'efficacité par de la lumière dont la 40 longueur d'onde 30 avoisine 495nm FISH : Types de sondes Peintures « WCP » – Totales = 1 paire de chromosomes – Partielles = seulement une partie (ex : un bras, une bande) Translocation autosome FISH : Types de sondes Spécifiques « LSI » – d'un locus – de plusieurs locus • Télomères (TTAGGG)n • Centromères (ADN satellite) Syndrome de la délétion 22q11 FISH : Types de sondes Centromériques « CEP » • Séquences communes (tous les centromères) • Spécifiques d'un centromère • Certains centromères ont des structures très proches : – 13/21 – 14/22 FISH : Types de sondes Sondes télomèriques • Sondes télomèriques aspécifiques (T2AG3) • Sondes subtélomèriques – Étude d'un télomère – De plusieurs télomères – De tous les télomères FISH : Types de sondes Sondes télomèriques Chromosome 1 Chromosome 4 Chromosome 2 Chromosome 5 Chromosome 3 Chromosome 6 Fish par microdissection chromosomique Pr Thomas Liehr http://ssmc-tl.com/sSMC.html http://upd-tl.com/upd.html Chromosome – microdissection 18 DOP-PCR amplification scheme: 3.3x106 FISH-experiments Microdissection and BACs/ ceps used for FISH-probe generation 21 Microdissection and BACs/ ceps used for FISH-probe generation 22 Microdissection plus breakpoint sequencing Tereza Jancuskova et al 2013 “cooperation with David Hardekopf, CHAMBON Laboratory for molecular diagnostics, Prague, Czech Republic and Dr. [...]
[...] HISTORIQUE Applications Diagnostic Postnatal Syndromes microdélétionnels DPN DPI PGS-A Oncohématologie Recherche Paramètres influençant l'hybridation in situ - Prétraitement : Élimination des protéines cytoplasmiques résiduelles Étape importante pour l'hybridation sur noyaux interphasiques. Pour l'élimination des protéines cytoplasmiques résiduelles : « emploi d'une protéinase ou de la pepsine ». La spécificité de l'hybridation : Lavages post hybridation : Ils permettent l'élimination des hybrides non spécifiques . Leur efficacité est liée est déterminée par: La température de lavage entre T ambiante et 72 °C. [...]
[...] Liehr group / Human Genetics Institute / JenaGermany Etude de Cas Pour quelles indications? Rechercher un syndrome microdélétionnel connu après orientation clinique: retard mental syndrome dysmorphique anomalie viscérale cardiaque) Caractériser une anomalie chromosomique dépistée sur le caryotype: définir le nombre de chromosomes impliqués dans un réarrangement préciser l'origine d'un chromosome marqueur surnuméraire • Incidence: 46,XY.ish del(7)(q11.23q11.23)(ELN-) • Incidence : 1/4000 ? 46,XY.del(22)(q11.2q11.2)(TUPLE1-) • Microdeletion in 70% of PW cases 46,XX.ish del(15)(q11.2q11.2)(SNRPN-) • Microdeletion = 70% of AS 46,XX.ish del(15)(q11.2q11.2)(UBE3A-) 17p13.3 17qter 46,XY.ish del 17p13.3 Age : 3 ans retard Psychomoteur dysmorphie faciale : hypertelorisme, epicanthus, strabisme convergent gauche, long philtrume. [...]
[...] Même groupe d'histocompatibilité HLA que l'enfant malade. Association d'une chimiothérapie intensive et un traitement immunosuppresseur contre le rejet de cette greffe. https://www.maghress.com/fr/lopinion/57122 Nuc.ish(DXZ1/DYZ3)[386]//(DXZ1X2)[14] Allogreffe de la moelle osseuse Sonde CEPX/CEPY 99% de noyaux XX de noyaux XY nuc ish(DXZ1,DYZ3)[2]//(DXZ1X2)[198] Application à la détection d'une amplification du gène ERBB2 dans le cancer du sein NA + monosomie Amplifié Hétérogène NA + Polysomie Amplifié Co-amplification Annales de pathologie(2014) 34, 352—365 Analyse chromosomique sur Puce à ADN (ACPA) Principe, Technique et Applications Terminologie • Caryotype moléculaire • CGH-array • CGH sur microréseau • CMA (Chromosomal Microarray Analysis) • Analyse Chromosomique sur Puce à ADN (ACPA) ACPA • Technique globale d'analyse du génome sur micropuces →Détection des variations de nombre de copies • Résolution de 1Kb à 1Mb • 2 types d'analyse en fonction des sondes spotées sur puce: - CGH (BAC, oligos) - SNP/ génotypage (Illumina, Affymétrix) ACPA • Résolution variable selon le pourcentage de recouvrement du génome, et par la densité des sondes présentes sur la lame • Ex: oligos: résolution 30-50 kb/ 100 fois plus sensible que le caryotype - 1 spot = 1 séquence d'ADN présente en multiples copies - Plus il y a de sondes différentes sur la puce à ADN, meilleure sera la résolution de la puce d'informations) Principe Principe ACPA: examen de première intention dans le retard du développement / Déficience intellectuelle 15%–20% vs L'ACPA/ Complément du caryotype en prénatal, dans certaines indications Technique Quel ADN témoin? [...]
[...] Tel 10q Tel 10p 46,XX,del10q26.ish(10qterx1) Tel 10p Tel 10q Pour quelles indications ? Recherche de trisomie 21 sur amniocytes o Signes d'appels échographique, biochimiques ou génétiques o Culture : 2 ml de liquide amniotique o Corrélation FISH–caryotype o Délai de réponse : 24h à 48h Cas Age maternel Age de Clarté nucale Risque estimé Antécédents grossesse à 12 SA par triple test particuliers Résultat 1/10 - Trisomie 1/50 - Normal 1/150 - Normal 1/140 - Normal - 1/10 - Normal - 1/50 - Normal 1/10 - Normal - 1/60 - Normal 1/10 - Normal - 1/10 - Normal Non fait - Normal 1/10 - Normal Non fait t (14;21) Trisomie 21 maternelle 1/60 - Normal 1/40 - Normal 1/10 - Normal 1/10 - Normal 1/20 - Normal 1/110 - Normal Non fait - Normal - 1/60 - Normal 1/50 - Normal 1/140 - Normal Tableau I : caractéristiques et résultats des patientes étudiées Cas Age maternel Age de grossesse Clarté nucale Risque estimé par Antécédents à 12 SA triple test particuliers Résultat - 1/50 - Normal - 1/40 - Normal Normal Normal - 1/200 - Trisomie - 1/35 - Normal Normal Normal Trisomie Normal Rassurer 29 couples amniocytes avec deux spots rouges du chromosome 21 Résultats rapides: en 24 heures. [...]
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