Le génome: extraction et séparation des acides nucléiques

Thèmes abordés

Génome, extraction, séparation, acides nucléiques, clonage moléculaire

Résumé du document

Pour obtenir la séquence d'un fragment d'ADN simple brin, on utilise une amorce complémentaire de l'extrémité 3' de ce fragment et on effectue avec une ADN polymérase la synthèse du brin complémentaire en présence des 4 désoxy-ribonucléosides triphosphate (dNTP) ainsi que d'une faible quantité de didésoxy-ribonucléosides triphosphates (ddNTP) marqués.
L'incorporation d'un ddNTP entraine l'arrêt de l'élongation de la chaine (pas d'OH en 3').
A chaque position de la chaine, un petit nombre de molécules sont ainsi arrêtés et marqués.

Extraits

[...] le type 2 est le plus utilisé en laboratoire 3600 connues) : l'enzyme reconnait une séquence et coupe au niveau de cette séquence. Le site de restriction est une courte séquence de séquence 4 à 8 paires de bases généralement palindromique Cours du Génome EXEMPLE : EcoR1 5' 3' GA A T T C 3' C T T A A G 5' Coupures 5' 3' G A A T T C C T T A A G Bouts cohésifs 3' 5' Il existe des enzymes qui reconnaissent la même séquence d'ADN spécifique comme site de coupure Ils sont appelés isoschizomères : s'ils reconnaissent la même séquence d'ADN et la coupe de façon identique néoschizomères : s'ils reconnaissent la même séquence d'ADN et la coupe de façon différente Fréquence statistique théorique d'un site de restriction ex : EcoR1 reconnait un site de 6 Pb La probabilité de rencontrer ce site est de = Au sein du génome humain, il y a donc statistiquement par cette enzyme 4096 = 7,3 105 sites reconnu Copier : les ADN polymérases. [...]

[...] Quantité approximative d'ADN obtenue à partir de différents matériels. Sources d'ADN 106 Cellules ADN obtenu 5 -10 Cellules basales (après un rinçage de bouche) Biopsie de villosité choriale (petits fragments) Sperme Racine de cheveux 50 mg de tissu 5 -100 ng 0,1 10 II. Les outils : couper, copier, coller. Couper : les enzymes de restriction. Identifiées en 1962 par W. Arber (Nobel en 1978) Enzymes d'origine bactérienne (Système de défense) Ce sont des endonucléases : elles catalysent la coupure de l'ADN double brin en un site spécifique : le site de restriction. [...]

[...] VII. Séquençage Exemple de séquence obtenue avec un séquenceur automatique Addition : au niveau de la séquence, insertion d'un ou plusieurs nucléotides. Quand multiple est différent de 3 ça ne change rien, ne décale pas le cadre de lecture. Pareil pour la délétion. Description des variations nucléotidiques Symboles officiels gènes et protéines- HUGO Séquence utilisée : accession et de version de la séquence de référence Genbank. Type de séquence de référence utilisée en faisant précéder la variation par une lettre. [...]

[...] On distingue différent types de vecteurs : plasmide, phagemide, bactériophage, cosmide, YAC, Yeast, artificial, chromosomes, Le clonage moléculaire permet : D'amplifier et conserver une séquence d'ADN. D'étudier une séquence d'ADN d'intérêt D'exprimer une séquence d'ADN d'intérêt D'introduire un gène dans des cellules ou d'un organisme De produire une protéine d'intérêt. VI. Technique d'amplification : la PCR. PCR = Amplification enzymatique in vitro Méthode d'analyse de l'ADN mise au point en 1983 par K. Mullis. (prix nobel de chimie en 1993) C'est une technique de réplication ciblée in vitro. [...]

[...] Au lieu d'être linéaire, l'amplification obtenue est exponentielle. Le résultat peut être qualitatif ou quantitatif Cours du Génome Chaque cycle d'amplification comprend 3 étapes : Dénaturation de l'ADN Hybridation des amorces (variable selon la séquence des amorces) Élongation extension des amorces par la Taq D Schéma La PCR Amorce Nucléotide Tampon Taq polymérase Thermocycleur. Amplification exponentielle : A chaque cycle, le nombre de copies du fragment d'ADN est doublé : 2n molécules dont ainsi obtenues après n cycle Manque d'enzymes, de d'NTP d'amorces Dégradation enzyme et d'NTP à haute Dénaturation altérée par trop grande quantité ADN Hybridation préférentielle de la cible avec elle-même plutôt qu'avec les amorces. [...]