Biologie cellulaire : Biologie moléculaire de la cellule

Résumé du document

Répresseurs : l'ADN interférence pour inhiber l'expression d'un gène.

- Facteur de transcription se fixe sur le promoteur et inhibe ou déclenche l'expression des gènes.
- Complexe protéique RISC rend silencieux un ARNm (...)

Extraits

[...] Soit c'est la protéine qui est marquée, soit c'est l'anticorps qui reconnaît la protéine. La localisation subcellulaire. Microscopie photonique : lumière blanche, fluorescence, confocale. Colocalisation : on sait où la protéine agit, on connaît aussi son expression. Conclusion Cytométrie de flux. PCR quantitative. Western-Blot. Culture cellulaire (antibiotique, température, transfections) les cellules s'attachent sur le plastique, pour éviter la contamination on met des antibiotiques et on diminue la température pour diminuer le métabolisme (4e jour). Transfection = pénétration d'ADN dans une cellule. Protéine chimère colocalisation. Hybridome de souris. Anticorps primaire/secondaire, monoclonaux, polyclonaux. [...]

[...] Culture cellulaire : si cellule vivante in vitro. Mesurer la structure et l'activité (enzyme) ainsi que les partenaires de la protéine in vitro biochimie. Déterminer la localisation subcellulaire de la protéine sauvage et mutée microscopie, anticorps, protéines de fusion, cytométrie de flux. Comprendre le rôle physiologique de cette protéine in vivo modèles animaux. Les animaux génétiquement modifiés La transgenèse = 1ère technique développée pour la surexpression d'un gène chez tous les animaux. On prend un ovule fécondé au stade 2 protonucléi (les 2 noyaux n'ont pas encore fusionné), on microinjecte des fragments d'ADN linéaires plasmides) sur lesquels on trouve un promoteur, puis on microinjecte l'ADNc du gène que l'on veut étudier. [...]

[...] En vert : cellules ayant ecombiné de manière homologue. En vert/jaune : cellules ayant recombiné de manière aléatoire, non homologue. Électroporation d'un blastocyste de souris C57BL/6 = pénétration de 2 cellules souches dans un oeuf de souris. Pas de garantie du résultat si le gène est important pour la souris souris non viables. Conclusion Les outils de la biologie moléculaire ont permis des avancées majeures en biologie cellulaire. Les modèles animaux complémentaires des techniques in vitro. Résoudre un problème de biologie cellulaire. Lien entre biochimie et physiologie. [...]

[...] Pour étudier l'expression d'une protéine dans une cellule on utilise un anticorps spécifique dirigé contre la protéine. (taille = poids moléculaire). Technique SDS-PAGE Séparation des protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide après traitement au sodium dodécyl sulfate. On s'assure que les protéines ont la même charge. Cette technique confère une charge à la surface des protéines. Dénaturation légère des protéines. Le β-mercato éthanol réduit les protéines (ponts disulfures). On les applique sur un gel de polyacrylamide : on met les protéines dans un puits. [...]

[...] obtention d'une lignée cellulaire fabriquant des anticorps monoclonaux spécifiques. Anticoprs polyclonal : mélange de plusieurs anticorps monoclonaux non séparés par une technique d'hybridome. Etudier l'expression des gènes Rappels. Exon = partie codante / Intron = partie non codante. introns pour 7 exons). Protection par côté et assure la protection des extrémités de l'ARNm. Mesurer l'expression des gènes mesurer la quantité d'ARNm (instable contrairement à l'ADN). La RT-PCR quantitative : La transcription inverse (RT). Amplification par PCR de l'ADNc. Quantification relative par SYBR-Green = molécule qui s'intercale entre 2 molécules d'ADN et devient fluorescente. [...]