Séparation et estimation des masses moléculaires de protéines

Thèmes abordés

Masse moléculaire, protéine, acides aminés, chromatographie, électrophorèse, lysozyme, ovalbumine, agent dénaturant, gel d'agarose, bleu de Coomassie, masse molaire, coefficient de partage, volume mort, dosage de Bradford, absorbance, gamme étalon, concentration, spectrophotomètre, calibration

Résumé du document

Au cours de ce TP, nous avons séparé plusieurs protéines avec deux méthodes différentes.
Les protéines sont des macromolécules constituées d'acides aminés possédant un groupement Amine et un groupement acide carboxylique.
Le but de ce TP est d'estimer la masse moléculaire, c'est-à-dire la somme des masses atomiques des différents atomes constituant une molécule, du lysozyme et de l'ovalbumine qui sont les deux protéines qui composent le mélange 4.
Pour estimer ces masses moléculaires, nous allons réaliser une électrophorèse en conditions dénaturantes, et une chromatographie d'exclusion stérique.

Extraits

[...] Nous avons désormais les distances de migration de chacune des protéines, ainsi, dans la prochaine partie de ce compte rendu, nous pourrons exprimer le logarithme des masses moléculaires en fonction de ce qu'on appelle la mobilité électrophorétique relative. Plaque d'électrophorèse numéro 2 : Partie chromatographie d'exclusion stérique Lors de cette expérience, nous avons eu affaire à un gros problème technique : le débit de notre colonne à chromatographie était beaucoup trop lent gouttes pour 5 minutes Ce problème technique est certainement dû à la taille de notre colonne (peut-être trop grande ou à un bouchon dans celle-ci. [...]

[...] Avec dx la distance de migration de la protéine. La mobilité électrophorétique : Sur notre plaque, on a mesuré 7,7 cm pour une bande. On rappelle que : dx cytochrome c = 4,8 cm dx BSA = 2,7 cm dx aprotinine = 5,0 cm dx anhydrase = 3,4 cm dx Lysozyme = 4,9 cm dx Ovalbumine = 3,5 cm MM cyctochrome c = 12,4 kDa MM BSA = 66 kDa MM aprotinine = 6,5 kDa MM anhydrase = 29 kDa Calculons R pour chacune des protéines des 3 mélanges : R cytochrome c = 4,8 / 6,8 = 0,71 R BSA = 2,7 / 6,8 = 0,40 R aprotinine = 5,0 / 6,8 = 0,74 R anhydrase = 3,4 / 6,8 = 0,5 R Lysozyme = 4,9 / 6,8 = 0,72 R Ovalbumine = 3,5 / 6,8 = 0,51 Maintenant, réalisons la courbe d'étalonnage (log = f faite à partir des marqueurs de masse moléculaire (c'est-à-dire les protéines dont la MM est connue) : Grâce à notre courbe d'étalonnage, faite à partir des logarithmes des masses moléculaires connues, nous pouvons estimer la masse moléculaire du Lysozyme et de l'Ovalbumine en faisant l'inverse du logarithme de la masse moléculaire. [...]

[...] Nous allons réaliser nos calculs, nos courbes, expliquer les erreurs et les problèmes de manipulation possible dans les parties suivantes de ce compte rendu, et cela, à la fois pour l'expérience de l'électrophorèse en conditions dénaturantes et pour la chromatographie d'exclusion stérique Exemple de ce qu'on obtient avec le réactif de Bradford : Résultats obtenus dans le mini compte rendu Partie électrophorèse en conditions dénaturantes Pour l'électrophorèse, après la coloration, nous avons mis le gel à décolorer toute la nuit. Après la décoloration, nous avons pu étudier la distance de migration des protéines des mélanges 2 à 4. [...]

[...] Séparation et estimation des masses moléculaires de protéines Présentation du TP Au cours de ce TP, nous avons séparé plusieurs protéines avec deux méthodes différentes. Les protéines sont des macromolécules constituées d'acides aminés possédant un groupement Amine et un groupement acide carboxylique. Dans un premier temps, nous avons séparé les protéines des mélanges 2 à 4 par électrophorèse : nous avons d'abord passé nos mélanges au vortex, puis nous les avons déposés dans les puits de la plaque numéro 2 (lettre du gel d'électrophorèse. [...]

[...] L'expérience sur la chromatographie nous a donné une masse moléculaire de 9,33 kDa pour le Lysozyme et de 44,70 kDa pour l'Ovalbumine. Nous pouvons en conclure que la chromatographie est une méthode plus fiable pour étudier la masse des protéines globulaire, en effet, l'électrophorèse nous donne une masse beaucoup plus faible pour l'Ovalbumine, nous sommes censés trouver une valeur autour de 45 kDa comme dans la partie chromatographie. Ceci est certainement dû au fait que l'électrophorèse a lieu en conditions dénaturantes, la structure native de la protéine va être détruire. [...]