Rapport Downstream - Purification du lysozyme et paramètres cinétiques

Thèmes abordés

SIBIOC Sciences de l'Ingénieur Industriel Biochimie, agrobiosciences, biochimie, enzyme, électrophorèse, dialyse, protéine, pH Potentiel hydrogène, lysozyme, downstream process

Résumé du document

Le lysozyme est une protéine globulaire d'environ 100 acides aminés. C'est un glycoside hydrolase acide, elle détruit donc la paroi des bactéries Gram + après leur capture par des phagocytes en catalysant l'hydrolyse des peptidoglycanes. Les bactéries Gram - ne sont pas dégradés par le lysozyme, car elles possèdent une couche externe de lipopolysaccharides, ce qui empêche la dégradation des peptidoglycanes. Cette enzyme a un rôle de défense contre les infections bactériennes. Le lysozyme se retrouve dans un grand nombre de tissus et de liquides biologiques (larmes, mucus, salive, sérum sanguin...). On le retrouve également dans le blanc d'oeuf. Sa synthèse s'effectue dans les globules blancs, et plus particulièrement dans les granulocytes et les monocytes.

Extraits

[...] Le complexe formé est de couleur mauve et peut-être dosé par spectrophotométrie à une longueur d'onde de 545 nm. L'absorbance mesurée est directement proportionnelle à la concentration de protéines par la loi de Beer-Lambert, ce qui permet le dosage des protéines. Cette méthode permet de déterminer la concentration de protéines dans une gamme de valeur allant de 2 à 20 mg/mL. On applique ce dosage sur toutes les fractions recueillies lors de la purification afin de dresser un bilan protéique. [...]

[...] Dans la littérature, on trouve un débit linéaire recommandé de 120 cm/h pour le gel CM séphadex C-25. Le débit recommandé en sortie de colonne est de 4,02 mL/min. On utilise donc un débit de 4 mL/min. ? = .0,82 = 4,02 On fait donc passer du tampon phosphate pH 8 dans la colonne contenant le gel. Après injection, on effectue des mesures d'absorbance sur la solution éluée. Lorsque l'absorbance est proche de cela signifie que toutes les protéines ont été éluées. Cette fraction est appelée F2nr. [...]

[...] Préparations Tampon phosphate 50 mM à pH 8 On prépare 3 L de ce tampon phosphate. Le tampon phosphate est préparé à partir de dihydrogénophosphate de sodium dihydraté (acide) et d'hydrogénophosphate de sodium dihydraté (base). Le pKa de ce couple acide/base est de 6,86. Le pH d'une solution tampon est calculé par cette formule : On doit résoudre un système de deux équations à deux inconnus. = 13,8 On détermine les masses d'acide et de base à peser (Mma = 156,00 g/mol et Mmb = 177,99 g/mol) : = = 1,59 ? [...]

[...] La purification s'effectue sur 50 mL de F0. On effectue d'abord une précipitation au sulfate d'ammonium. Le pourcentage de saturation final doit être de La masse de sulfate d'ammonium a ajouté est de : La masse de sel pesée est de 14,56 g et l'ajout se fait par petites portions sous agitation. Après l'ajout du sel, la solution est centrifugée afin de séparer les protéines les plus grosses des plus petites. Le volume de surnageant récupéré est de 49 mL et le volume du culot (remis en suspension) est de 41,5 mL (F1c). [...]

[...] Tampon phosphate pH mmol/L On prépare 500 mL d'un tampon phosphate pH 7 de concentration 66 mmol/L. Le tampon phosphate est préparé à partir de dihydrogénophosphate de sodium dihydraté (acide) et d'hydrogénophosphate de sodium dihydraté (base). Le pKa de ce couple acide/base est de 6,86. Le pH d'une solution tampon est calculé par cette formule : On doit résoudre un système de deux équations à deux inconnus. = 1,38 On détermine les masses d'acide et de base à peser (Mma = 156,00 g/mol et Mmb = 177,99 g/mol) : = = = 2,16 ? [...]