Le lysozyme de blanc d'oeuf

Résumé du document

Ce travail sur le lysozyme de blanc d'œuf a permis de tester et de comparer différentes techniques de travail sur les protéines. Durant la première phase de l'expérience le lysozyme a été extrait du blanc d'œuf et purifié grâce à un support échangeur de cations. Dans un deuxième temps le processus de purification a été affiné et des tests ont été effectués afin de comparer les différentes méthodes utilisées. Les méthodes de purification utilisées sont la mesure de l'activité enzymatique, le dosage des protéines par la méthode de Folin-Lowry et le dosage des protéines par la méthode de Lowry modifiée. La pureté de l'extrait a été évaluée grâce à une électrophorèse sur gel d'agarose, une mesure d'absorbance et une chromatographie d'exclusion moléculaire.

Extraits

[...] 5mL sont mis de côté pour la gamme étalon. Pour les autres pH, il suffit d'ajuster de l'HCl 1M (goutte à goutte) dans la solution pH8 (dans un autre bécher avec un agitateur et la sonde pH- mètre immergée dans la solution) afin de faire baisser le pH. Lorsque celui- ci atteint pH=7; 5mL sont prélevés et mis de côté pour la gamme étalon. L'opération est répétée pour tous les pH de la gamme étalon. On obtient alors le tableau suivant : Mesure de l'activité enzymatique en fonction du pH Pour cette étude, il est nécessaire de travailler en conditions saturantes pour l'enzyme afin d'etre sur que les variations d'activité observées ne sont pas liées à un défaut de substrat. [...]

[...] Cependant, les deux courbes ont la même allure. Les essais ont été effectués enzyme par enzyme et non pH par pH ce qui élimine d'éventuelles erreurs de tampon ou de blancs au niveau du spectrophotomètre. Le tampon pH 6.2 utilisé pour cette manipulation est le même que celui utilisé pour l'ensemble des expériences. Le problème ne provient donc pas de lui. Toutefois, il est possible que le tampon pH 6 ait été mal fabriqué. [...]

[...] Pour cela, on met 6,25 µL de sérum albumine bovine dans 993,75 µL de sérum physiologique. Préparation de la gamme d'étalonnage On ajoute ensuite 5 mL de solution D. La solution D est préparée au moment de l'emploi. On mélange: 0,5 mL de solution alcaline à 20g/L de Na2CO3 dissoutes dans NaOH à 0,1M 0,5 mL de solution tartrate à 20 g/L 50 mL de solution de sulfate de cuivre à 10 g/L On laisse reposer 10 minutes avant d'ajouter 0,5 mL de réactif de Folin. Ce réactif a été dilué extemporanément au 1/3. [...]

[...] Ceci est certainement du à un problème de colonne, puisque les autres groupes ont rencontrés ce même problème 4Etudes des paramètres cinétiques Pour l'enzyme commerciale : Afin de respecter les conditions opératoires prédéfinis, on ne travaillera que sur 2.5 mL des différentes dilutions de S fabriquées. D'où : D'après le graphique on trouve que : Vm = 0.79 Km = 0.93 g/L Pour E : Afin de respecter les conditions opératoires prédéfinis, on ne devrait travailler que sur 2.5 mL des différentes dilutions de S fabriquées. Mais nous ne disposons que de très faibles quantités de E purifiée. [...]

[...] La méthode de Folin-Lowry utilise le réactif de Biuret en présence de phosphomolybdate (réactif de Folin) et de phénol. La lecture se fait par spectrophotométrie entre 550 et 700nm. Dans le cadre du TP, la longueur d'onde est de 650 nm. A partir d'une solution étalon à 0,5 g/L de sérum albumine, on réalise une série de tubes contenant de 0 à 100 µg de protéines par tube. Comme les tubes sont complétés à 1 mL par du sérum physiologique, on aura de 0 à 100 µg/mL de protéines. [...]