Étude cinétique et purification de l'invertase issue de Saccharomyces Cerevisiae - Laboratoires de Down Stream Processing

Thèmes abordés

Master 2 en sciences de l'ingénieur industriel orientation chimie/biochimie, invertase, étude cinétique, extraction, purification, électrophorèse SDS-Page, réactif Lowry-Folin, réactif Biuret, réactif DNS, solution de saccharose, solution de chlorure de sodium, Saccharomyces Cerevisiae, vitesse initiale, activité enzymatique, dosage protéique

Résumé du document

Le but est d'étudier la cinétique enzymatique de l'invertase :
- Concentration de l'enzyme
- Concentration du substrat, Km et Vmax
- Influence de la température et du pH
- Influence des inhibiteurs
Extraire et purifier la forme intracellulaire et extracellulaire de l'invertase à partir d'une culture de Saccharomyces Cerevisiae

Saccharomyces Cerevisiae est une espèce de levure faisant partie du règne des fungi (champignons). Les levures se distinguent dans ce règne par leur structure (eucaryote unicellulaire) et leurs caractéristiques biologiques spécifiques (reproduction par bourgeonnement ou division, ...). Elles ont une forme ovoïde ou sphérique, avec une longueur de 6 à 12 µm pour 6 à 8 µm de largeur.

Extraits

[...] Il est alors possible de calculer Km : La pente de la droite est définie comme 1/Vmax. Le glucose est bien un inhibiteur compétitif. La variation du Km est importante (11,11 mM sans inhibiteur contre 45,14 mM avec inhibiteur). Cela se traduit par une affinité beaucoup plus faible pour le saccharose, en présence de glucose. La variation de la vitesse maximale est très faible (0,268 ?µmol/mL/min sans inhibiteur contre 0,256 ?µmol/mL/min avec inhibiteur). La différence n'est pas suffisamment significative pour être causée par l'inhibiteur. [...]

[...] Celle-ci fournit des résultats plus fiables lorsque l'on a beaucoup de données après le Km, ce qui est le cas. En plus, elle permet de réduire les erreurs sur des concentrations faibles en substrat. Les dilutions qui ont dû être réalisés pour atteindre ces valeurs de concentrations sont conséquentes (jusqu'à un facteur de dilution de 900x). Cela peut mener à des erreurs de précision lors des dilutions. Le Km de la réaction est de 11,11 mmol/L et la vitesse maximale est de 0,268 ?(µmol/mL)/min. Le Km est concordant avec de qu'on retrouve dans la littérature. [...]

[...] La masse molaire de saccharose est de 342,3 g/mol. La masse a pesée est de : On pèse une masse de 15,4 g de saccharose et on la dissout dans un volume de 50 mL de tampon acétate pH 4,66. 3.6 Solution de chlorure de sodium 2 mol/L La solution de chlorure de sodium 2 mol/L est utilisée pour l'élution de l'enzyme lors de la chromatographie ionique. On préparer 500 mL de NaCl 2 mol/L. La masse a pesé est de 58,44 elle est dissoute dans 500 mL de tampon acétate pH 4,66. [...]

[...] Le facteur de dilution total est de : Pour le surnageant mL de solution ont été placés dans le boudin de dialyse. Après la dialyse, le volume de la solution était de 44 mL. Lors du dosage de Biuret, un facteur de dilution de 1,25 a été appliqué à la solution protéique. Le facteur de dilution total est de : Exemple de calcul (Surnageant essai 1) : Pour cette fraction, l'absorbance mesurée est de 0,247. La méthode utilisée est celle du Biuret, la droite d'étalonnage est : ? = 0,0452 ? [...]

[...] Fraction Facteur dilution Absorbance Concentration protéines (mg/mL) Surnageant 0 1,25 0,247 6,739 0,243 6,629 0,244 6,657 Surnageant 1 1,58 0,146 4,999 0,142 4,859 0,145 4,964 Culot 1 1,25 0,941 25,932 0,949 26,153 0,948 26,126 Surnageant 2 2,2 0,278 13,370 0,278 13,370 0,278 13,370 Culot 2 1,25 0,123 3,310 0,122 3,283 0,119 3,200 Retenu 5 0,243 0,462 0,232 0,440 0,235 0,446 Non retenu 100 0,196 7,383 0,182 6,831 0,185 6,949 Les facteurs de dilution tiennent compte de la dilution des protéines dans un volume total de 1 mL. Pour les surnageants dyalisés, le facteur de dilution prend en compte en plus la dilution liée au phénomène d'osmose lors de l'étape de dyalise. Les concentrations finales sont donc exprimées pour les surnageants non dyalisés. [...]