Technique d'étude des protéines

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Cours de 2éme année de licence BGS. Technique d'étude des protéines. 26 pages.

Extraits

[...] Endopeptidases hydrolyse à intérieur de la chaîne Exopeptidases hydrolyse les extrémités. ex: Les carboxypeptidases A et B exopeptidases qui détachent les aa du coté CT sauf si R n-1 est une Pro Les aminopeptidases exopeptidases qui détachent les aa du coté NT sauf si aa est une Pro Endopeptidases coupures aspécifiques : importe où dans la chaîne subtilisine pronase papaine coupures spécifiques : - la coupure est de type C (soit aprés le CO de reconnu, à droite) aa - la coupure est de type N aa (soit avant le NH2 de reconnu, à gauche) Exemples d'endopeptidases typsine = spécifique des aa basiques coupure de type C coupe aprés Arg et Lys sauf si Rn+1=Pro α-chymotrypsine = spécifique des aa aromatiques coupure type C aprés Phe, Tyr, Trp sauf si Rn+1=Pro ( Le tryptophane est souvent dénaturé lors des traitements acides ) thermolysine = spécifique des aa hydrophpobes coupure de type N avant Leu, Ile, Val sauf si Rn-1=Pro protéinase V8 = spécifique des aa acides coupure type C aprés Asp, Glu sauf si Rn+1=Pro En milieu carbonate d'ammonium après Glu seulement 5 - Méthodes de Séquençage sur analyseur automatique méthode d'Edman : phénylthioisocyanate le phénylthioisocyanate ( PTIC ) se fixe sur le NT le produit de condensation formé auto hydrolyse libérant ainsi aa1-PTH et un nouvel NT la méthode est séquentielle et se poursuit de 30 à 50 fois aa1-PTH est isolé et identifié, puis 2-PTH . [...]

[...] aa Cette méthode est la plus classique 6 - Détermination de la séquence primaire Déterminer la séquence de tous les petits peptides obtenus à partir des diverses hydrolyses. Faire les regroupements par comparaison des recouvrements permettant de finaliser la séquence du peptide. [...]

[...] LICENCE BGS SEMESTRE 3 UEP Structures et Propriétés des Biomolécules Présentées par Nicole LAURENT Techniques d'études : Aa, peptides, protéines Acides aminés 1 - Protection de la fonction α-NH - Protection de la fonction α-COOH 3 - Caractérisation des α-amino-acides 4 - Chaînes latérales 5 - Séparation et dosage II Structure primaire des protéines 1 - Composition en α-amino-acides 2 - Détermination du NT et CT 3 - Ponts disulfures et libres 4 - Fragmentations spécifiques 5 - Méthodes de Séquençage 6 - Détermination de la séquence primaire III - Purification et caractérisation des protéines I - Acides aminés 1 - Protection de la fonction α-NH2 a - Formation d'amide = acylation b - Formation d'uréthanes 2 - Protection de la fonction α-COOH a Estérification 3 - Caractérisation des α-amino-acides a - Coloration par la ninhydrine b Réaction de SANGER c Méthode du chlorure de dansyle d Réaction d'EDMAN e - Réaction de Van Slyke 4 - Chaînes latérales 5 - Séparation et dosage 1 - Protection de la fonction α-NH2 a - Formation d'amide = acylation R1-CH-NH2 + R2-CO-Cl COOH aa chlorure d'acide R1-CH-NH-CO-R2 + HCl COOH N-alkylamide R2 = CH3 (méthyl) protection du grpmt NH2 b - Formation uréthanes R3-O-CO-Cl + NH2-CH-COOR2 R1 chlorocarbonate aa R3-O-CO-NH-CH-COOR2 + HCl R1 uréthanes fonctions de protections temporaires de NH2 R3= Z = phényl-CH2-O-CO-Cl = chlorocarbonate de benzyle ter-butyle R3=Boc= (CH3)3-C-O-CO-Cl = La régénération est possible en présence de catalyseurs Ces protections sont indispensables si l'on veut obtenir une synthèse peptidique particuliaire - Protection de la fonction α-COOH a - Estérification protection temporaire de la fonction α-COOH NH2-CH-COOH R1 + R'-OH NH2-CH-COOR' + R1 H2O - CH3 - C-(CH3)3 -phénol-NO2 méthyl tertiobutyl nitrophénol 3 - Caractérisation des α-amino-acides a - Coloration par la ninhydrine Propriété des fonctions α-COOH et α-NH2 Tous les acides aminés sont bleu-violet-rose Sauf Pro en jaune Réalisable en milieu liquide ou solide (pulvérisation ) b Réaction de SANGER (voir + loin) c Méthode du chlorure de dansyle (voir + loin) d Réaction d'EDMAN (voir + loin) e - Réaction de Van Slyke NH2-CH-COOR + HNO2 R1 N2 + HO-CH-COOR + H2O R1 sur un peptide cette réaction se fait uniquement sur le NT a - Coloration par la ninhydrine 1ière ninhydrine 2ième ninhydrine bleu-violet-rose Réaction 1 Réaction - Chaînes latérales sur les -SH des cystéines dégradation par oxydation et décarboxylation SH-CH2-CH-COOH NH2 SO3H-CH2-CH-COOH NH2 SO3H-CH2-CH2 Taurine NH2 réaction de folin = réaction spécifique des résidus aromatiques réaction de sakaguchi = spécifique des Arg réaction avec les phénols = spécifique de la Tyr jaune avec acide nitrique rouge par addition d'ammoniaque 5 - Séparation et dosage des aa Séparation : ( voir + loin ) Par chromatographie échangeuse d'ion Par chromatographie CCM Par électrophorèse Dosages ( voir TP ) Colorimétrie Spectrophotométrie UV pour les acide aminés aromatiques Spectrofluorométrie II - structure primaire d‘une protéine NT aa1-aa aa(n-1)-aa(n)-aa(n+ CT stratégie utilisée 1 - Détermination de la Composition en aa par hydrolyse totale de toutes les liaisons peptidiques ( HCl 6N, 110°C à 72h sous vide) NH2-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-COOH R1 R2 R3 R4 R5 R6 Trp souvent dénaturés. [...]

[...] - Coupure au hasard - les fragments obtenus auront des parties communes superposables à partir desquelles, la structure de départ pourra être réobtenu. Peptide de départ Peptides hydrolysés Site d'hydrolyse Hydrolyse chimique spécifique: BrCN = bromure de cyanogène spécifique des Met coupure de type C aprés Met M M M M M Hse Si Met en CT, Met est transformée en Homosérine (Hse) NH2-CH-COOH NH2-CH-COOH CH2-CH2-OH Hse CH2-OH Ser Coupure de type N Coupure de type C ----NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO---Rn-1 Rn Aa reconnu Rn+1 b - coupures enzymatiques spécifiques Les peptidases hydrolysent la liaison peptidique. [...]

[...] Localiser des ponts disulfures par comparaison des séquences primaires avant et après rupture des ponts disulfures. [...]