Les méthodes chromatographiques

Résumé du document

Cours de première année de BTS (analyses biologiques et biotechnologies) de Biophysique, sur les différentes méthodes chromatographiques (CCM, échangeuse d'ions, CPG, HPLC ... ). Certains schémas manuscrits et lisibles : colonne, CPG, HPLC, injecteur. Une partie est consacrée aux critères d'évaluation de la performance de séparation en chromatographie.

Extraits

[...] Il y a donc une mauvaise dispersion, les pics sont plus larges. d.) La dispersion longitudinale : Les éléments diffusent vers l'avant et l'arrière, mais le déplacement est favorisé par le flux vers l'avant, étant à l'origine de l'élargissement des pics. Le phénomène de diffusion provoque l'élargissement de la bande et donc du pic. e.) Cinétique et transfert de masse : Il s'agit d'un facteur ayant le plus grand effet sur l'efficacité et donc sur la dispersion, c'est-à-dire sur le transfert de molécules entre la phase mobile et la phase stationnaire. [...]

[...] Les ions régénérants sont de petits ions fortement chargés, parmi lesquels on distingue : OH-. Remarque : On travaille souvent en élution par gradient de pH, adapté à la séparation des acides amines, caractérisés par leur pHi (point isoélectrique, pH neutre). Exemple d'application : On veut séparer 3 acides aminés regroupés dans le tableau ci contre : Le pH de l'éluant étant de pH0 = 3 Le pH de l'éluant étant inférieur à celui du pH des acides aminés, et sachant que les acides aminés sont sous forme d'acide, la résine échange donc des cations. [...]

[...] Ainsi, de part la gravité, ce sont les molécules les plus lourdes qui sortent en premier. CHROMATOGRAPHIE D'AFFINITE : Principe : Technique utilisée pour les protéines qui forment avec certaines molécules des complexes spécifiques et réversibles. La chromatographie d'affinité est basée sur les interactions entre un ligand lié par covalence à un support inerte (phase stationnaire) avec un partenaire d'affinité en solution. L'un des deux constituants, ligand ou partenaire est une protéine. Protéine + Ligand ( Protéine-ligand La formation du complexe Protéine-ligand est caractérisée par une constante de fixation (équivalente d'une constante chimique) K : / K étant spécifique au partenaire et au ligand. [...]

[...] La composition de l'élément en fonction du temps étant programmable. Une injection est réalisée toutes les 22 minutes. Il faut là aussi, plusieurs conditions, c'est-à-dire, que les solvants soient de qualité HPLC, filtrés et dégazés La pompe : Elle permet le passage de la phase mobile dans la colonne à un débit voulu, compris entre 0,5 et 1 mL/minute. La pression est quant à elle comprise entre 50 et 200 bars, mais elle peut atteindre parfois 600 bars. La pompe constitue la partie la plus fragile de l'appareil. [...]

[...] On parle de phénomène d'élution (décrochage des molécules). Eléments de la chromatographie d'adsorption Les adsorbants : Ce sont des solides très divisés (réduits en poudre microscopique) Ex : 1g d'alumine couvre une surface de 100 La qualité d'un adsorbant dépend de plusieurs critères : La polarité, la granulométrie. En effet, plus les grains sont fins, meilleure sera la séparation mais elle sera ralentie, et plus lente. Les solvants : Parmi les solvants, on peut citer, le papier cellulose, l'amidon, le talc, l'oxyde de magnésium, le gel de silice . [...]