Compte-rendu de Biochimie - Gel d'electrophorèse SDS-PAGE (L2)

Thèmes abordés

Compte-rendu de Biochimie, gel d'electrophorèse SDS-PAGE (L2), protéines, gel de Séphadex, sérumalbumine bovine, solution de polyacrylamide, persulfate d’ammonium, polymérisation, tampon de migration, cytochrome

Résumé du document

Le SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide) est une technique de gel d'électrophorèse. Cette technique consiste à faire migrer des protéines dans un gel, grâce à un courant électrique, afin de les séparer en fonction de leur masse moléculaire. Lors d'un précédent TP, la sérumalbumine bovine (SAB, Mr= 66,0kDa) et le cytochrome c (12,4kDa) ont été séparés par chromatographie d'exclusion sur gel de Séphadex, en fonction de leur taille.

Extraits

[...] C'est un indicateur de pH qui devient bleu en milieu basique. De plus, le fond de migration est marqué. Les protéines migrant au-dessus de ce fond de migration, il devient plus simple de stopper le courant au bon moment, stoppant ainsi la migration. D. Mise en place de la migration. Le gel polymérisé est alors formé de deux gels différents. Ce dernier, coincé entre deux plaques, est transféré dans la cuve à électrophorèse. Chaque échantillon est déposé dans un puits suivant l'ordre suivant: les marqueurs masse moléculaire, le sérum albumine de boeuf la protéine cytochrome et le mélange composé des protéines précédentes. [...]

[...] Cependant la bande très épaisse correspond au cytochrome c. Dans le mélange protéique présent dans le dépôt il y a la présence d'une bande foncée à 58,9 kDa, correspondant à la protéine SAB. Ensuite une autre bande claire, diffuse, apparait vers 16,6kDa, se rapprochant ainsi de la masse moléculaire du cytochrome c permettant ainsi de l'identifier. De même que pour la solution B contenant la SAB, certaines bandes peu marquées apparaissent entre 45 et 120 kDa. Dans le mélange protéique, les 2 protéines sont présentes. [...]

[...] Un pont de bis-acrylamide est alors formé entre deux chaines linéaires d'acrylamide. C'est donc un accélérateur de polymérisation Après avoir mélangé, le futur gel est prélevé et coulé entre les deux plaques. Afin d'éliminer les bulles, de l'isosulfate a été rajouté entre ces plaques. Le gel de séparation est moins acide que le gel de concentration. Les mailles sont plus petites étant donné qu'il est fortement concentré en polyacrylamide. Ce gel joue le rôle de tamis, en ralentissant les protéines les plus grosses. [...]

[...] Le peigne fut rajouté afin de créer ces trous de dépôts. Le gel de concentration est peu concentré et possède des mailles larges. A un pH de les ions chlorures seront alors chargés et vont permettre, sous l'action du champ électrique de concentrer les protéines en une bande fine. C. Préparation des échantillons 4 solutions protéiques ont été préparées dans des tubes eppendorfs. La première contient 5uL de marqueurs de masse moléculaire, permettant par la suite, à la détermination du poids moléculaire des protéines présentes dans les autres solutions. [...]

[...] Ensuite uL de la protéine cytochrome c a été injecté dans un nouveau tube. Enfin, la dernière solution préparée est un mélange composé des protéines précédentes. Dans ces 4 tubes a été rajouté 5uL du tampon de dépôt dénaturant de concentration 1X. Ce tampon est composé du tampon tris-HCl, de SDS à de glycérol à du B-mercaptoéthanol à une concentration de 14,4mM et enfin du bleu de bromophénol à Les rôles du Tris-HCl et du SDS ont été expliqués préalablement. [...]