Travaux pratiques: Le cytosquelette des cellules cancéreuses de colon Humain HT29.

Résumé du document

Le but de cette expérimentation est de comparer le cytosquelette de cellules cancéreuses de colon humain HT29 par rapport au cytosquelette de cellules saines au niveau de l'agencement de protéines.
Pour pouvoir comparer ces cellules, il faut détecter les protéines du cytosquelette. On s'intéresse à quatre protéines, la tubuline, l'actine, l'α-actinine et la cytokératine et à leurs localisations intracellulaires.
Le principe de la détection des protéines par Immunofluorescence Indirecte :
Une protéine donnée peut être considérée comme un antigène par un anticorps spécifique monoclonal. Cet anticorps est lui-même reconnu par un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome. C'est ce dernier qui, par immunofluorescence, permet de localiser la protéine d'intérêt. L'anticorps secondaire est polyclonal, ce qui signifie qu'ils peuvent se fixer à plusieurs sur le premier anticorps et amplifier le signal.

Extraits

[...] Donc cela purifie d'une part une protéine et d'autres part, avec un étalon connu qui peut être une protéine semblable (dans notre ex actine et L'α actinine dans une cellule saine) Électrophorèse : on fait migrer des protéines dénaturées (chargés négativement) dans un gel (agarose ou acrylamide de préférence), sous un champ électrique. Les protéines migrent en fonction de leur taille : plus elles sont grosses et plus elles ont du mal à avancer et restent coincées dans le gel. Ainsi, en comparant protéine venant de cellules saines et protéine venant de cellules cancéreuses, on peut voir si elles ont la même taille. [...]

[...] α, β se polymérisent en microtubules et servent à mouvoir les vésicules intracellulaires, tandis que les protéines γ arrangent les microtubules au sein du centrosome. Sa répartition : elle est sous forme de filaments isolés qui rayonnent vers l'extérieur dans tout le cytoplasme, à partir d'une région proche du noyau. Les résultats précédents d'immnomarquage correspondent bien à cette répartition filamenteuse dans le cytoplasme. Donc apparemment, la tubuline et les microtubules ne sont pas défectueux dans les cellules cancéreuses de colon. [...]

[...] Volume dans lequel toutes les incubations et rinçages seront réalisés. Le PBS est composé de NaCl 0,138M KCl 2,7 mM Na2HPO mM KH2PO mM Exemple de calcul: Masse = masse moléculaire (g/mol) x concentration (mol/l) x volume NaCl 58,44 x 0,138 x 0,05 = 0,40 g Dans 50mL à PH compris entre 7,2 et 7,4. Le PBS permet d'enlever les traces des protéines, tout en respectant l'osmolarité des cellules. De plus, le PBS a l'avantage de respecter les conditions salines et de pH pour permettre l'interaction antigènes - anticorps. [...]

[...] Discussion Une mauvaise répartition du cytosquelette est observée pour l'actine et l'actinine. Hypothèses : le dysfonctionnement pourrait venir d'une part de l'actine, d'autre part de l'actinine, des deux protéines, ou alors d'une autre protéine, qui interviendrait dans la polymérisation de l'actine. Si le dysfonctionnement provient de l'actine : l'actine est bien présente dans le cytoplasme des cellules cancéreuses mais sous forme de monomères et non de polymères. Donc le problème viendrait de la polymérisation qui ne se fait pas, ou se défait. [...]

[...] Toutes les étapes suivantes se feront à l'abri de la lumière pour empêcher la disparition de la fluorescence sous UV. Rinçage pour éliminer les anticorps secondaires en excès 3 fois 5min au PBS Tween 0,05%. Observation Commencer par enlever les compartiments des parois délicatement Puis déposer une goutte de solution de montage. Ceci permet de diminuer la vitesse de disparition de la fluorescence sous UV. Enfin, faire l'observation au microscope optique pour repérer les régions de la lame intéressantes puis observer au microscope à épifluorescence. Ceci permet d'envoyer des UV et d'exciter le fluorochrome. [...]