Travaux pratiques de biologie moléculaire

Thèmes abordés

Biologie moléculaire, cellules, protéine virale, plasmide, étude électrophorétique

Résumé du document

La transfection transitoire permet de tester l'expression d'une protéine donnée dans une cellule eucaryote. Il existe plusieurs types de cellules qui peuvent être utilisés en transfection transitoire: cellules COS, cellules de rein 293, cellules d'ovaire d'hamster chinois CHO.
Les cellules COS proviennent de rein de singe vert d'Afrique. Elles ont été transfectées avec l'origine défective du virus SV40 (Simian Virus 40). La cellule COS a donc intégré dans son ADN génomique cette séquence virale. Cette cellule produit l'antigène grand T, mais ne produit pas de particule virale. Cet antigène grand T est la seule protéine virale nécessaire pour la réplication virale. Ainsi tout plasmide, introduit dans cette cellule,contenant l'origine de réplication du SV40, sera répliqué en grand nombre de copies (10000 à 100000 copies/cellule).

Extraits

[...] Déposer 100 µl de la solution de BSA à 100µg/ml dans chaque puits (prévoir 4 colonnes, soit 8 x 4 = 32 puits à fond plat). Placer la plaque une nuit au frigo à 4°C. Etape de saturation Déposer 200µl de PBS1x Tween gélatine/ puits. Incuber 30 minutes à température ambiante. Préparation de la gamme (en tubes eppendorf) A partir d'une solution d'anticorps anti-BSA à 3µg/ml, préparer 6 dilutions successives de 1/2 en 1/2 (sachant que pour chaque point de gamme, on déposera 50 µl de solution d'anticorps en triplicate). Les dilutions se font dans du PBS Tween. [...]

[...] Pour cela, prélever 5 cm3 de surnageant en ayant soin de ne pas remettre en suspension le précipité (utiliser une pipette munie d'une propipette). Ajouter 2 cm3 du réactif précédent. Agiter. Attendre 10 min et lire la DO à 660 nm (Note mode photométrie p21) en faisant le zéro du spectrophotomètre avec le surnageant du tube contrôle. Questions et résultats Rôle du TCA ? But du tube contrôle ? Dosage du phosphore du surnageant de centrifugation A l'aide de la courbe étalon, déterminer la quantité de phosphore libéré pendant la réaction enzymatique. Exprimer les résultats en : - µg de phosphore. minute-1. [...]

[...] Attendre que tout l'échantillon ait pénétré dans le gel. Puis, sans arréter la chromatographie, déposer à la suite de l'échantillon 200µL environ de tampon phosphate 0,01M pH 7,5 pour entraîner le reste d'échantillon ; attendre qu'il ait pénétré avant d'ajouter encore du tampon jusqu'en haut de la colonne. Visser à fond le bouchon rouge en évitant de tordre le tuyau. Enlever la vis de purge pour éliminer l'air pris en haut du bouchon, la remettre rapidement. Pendant ce temps, l'élution continue : ne pas l'arréter. [...]

[...] Quel gel doit-on utiliser pour déterminer la masse moléculaire de la protéine X ? Voir les shémas page suivante T.P. N°4b Jeudi ALCOOL DESHYDROGENASE DE LEVURE DE BOULANGERIE Analyse cinétique (3ème jour) 1 Détermination de l'activité enzymatique de P2 le 3ème jour Les mesures d'activité seront effectuées selon le protocole défini précédemment en utilisant une dilution appropriée dans l'eau distillée du précipité P2 obtenu le 2ème jour. Pour cela, effectuer une dilution de P2 pour avoir une variation de DO linéaire à partir de l'origine d'environ : 0,1 [...]

[...] Eviter de faire bouillir. Peser le persulfate d'ammonium à 0,1 g pour 1 mL d'eau distillée Nota: L'acrylamide est une substance neurotoxique; pour éviter tout contact avec la peau, utiliser les gants en latex. Dans un bécher, ajouter successivement, selon le matériel dont vous disposez: - Acrylamide/bisacrylamide - Tampon Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 - Eau distillée - SDS - Gélatine chaude ou eau distillée Bien homogénéiser sans faire de bulles et ajouter ensuite: 0,022 mL - Persulfate d'ammonium Agiter. [...]