Régulation par le fer de l’expression de l’ARNm du récepteur de la transferrine dans la lignée cellulaire humaine 293

Résumé du document

La protéine RTf est un récepteur à la transferrine. Son expression régule la captation cellulaire du fer lié à la transferrine circulante. La transferrine est synthétisée dans le foie puis dans le plasma, elle est la principale protéine de transport du fer. Les cellules peuvent réguler leur absorption en fer en modulant le nombre de récepteurs à la transferrine qui sont exprimés à leur surface. Pour cela, elles utilisent des éléments de réponse au fer (IRE) qui régulent la transcription des récepteurs à la transferrine par l'ARNm.

Les récepteurs à la transferrine sont présents dans presque toutes les cellules, mais plus particulièrement dans les hépatocytes, érythrocytes immatures, cellules en division rapide malignes ou non malignes. La ferritine est une molécule de stockage intracellulaire du fer qui emmagasine celui-ci sous forme facilement accessible aux cellules. La libération du fer peut être contrôlée par réponse aux besoins de l'organisme. La ferritine permet la libération en plus ou moins grande quantité en cas de déficit ou d'excédent. Cette protéine est située dans les macrophages réticuloendothéliaux et les hépatocytes.

Le but de ce TP est de comprendre la régulation de la transcription du récepteur à la transferrine en fonction de la concentration de fer présente dans le milieu à l'aire d'une RT PCR.

Extraits

[...] Régulation par le fer de l'expression de l'ARNm du récepteur de la transferrine dans la lignée cellulaire humaine 293 La protéine RTf est un récepteur à la transferrine. Son expression régule la captation cellulaire du fer lié à la transferrine circulante. La transferrine est synthétisée dans le foie puis dans le plasma, elle est la principale protéine de transport du fer. Les cellules peuvent réguler leur absorption en fer en modulant le nombre de récepteurs à la transferrine qui sont exprimés à leur surface. [...]

[...] En effet, si le milieu a une faible concentration en Fer, la quantité d'ARN de Rtf est élevée afin de former des récepteurs et capter des molécules de Fer. Discussion La stabilité de certains ARNm répond à des signaux extracellulaires. Comme pour l'ARNm codant le récepteur de transferrine, une protéine qui capte le fer à la surface des cellules de mammifère. La densité du récepteur à la transferrine à la surface de la cellule s'ajuste sur la disponibilité en fer, en grande partie par ajustement de la stabilité de son ARNm. [...]

[...] Le résultat attendu est une faible fluorescence pour l'échantillon cultivé avec du fer, une forte fluorescence pour celui cultivé avec un chélateur de fer et une fluorescence moyenne pour l'échantillon témoin. Sachant que la fluorescence est proportionnelle à la quantité de protéines et dans ce cas présent, elle est proportionnelle à la quantité de récepteurs à la transferrine. Ainsi, la traduction de l'ARNm du récepteur à la transferrine est observée. [...]

[...] Puis ces cellules sont lysées et centrifugées afin de purifier les protéines. Avec les 3 solutions obtenues, un western blot est réalisé. Du SDS (détergeant) est ajouté aux solutions afin que les protéines soient chargées négativement. Une électrophorèse sur gel est réalisée et les protéines contenues dans les solutions migrent selon leurs tailles. Quand l'électrophorèse est terminée, elle est transférée sur une membrane puis cette membrane est incubée avec des anticorps spécifiques du récepteur de la transferrine qui sont couplés à une molécule fluorescente. [...]

[...] A 260nm, la concentration en ADN, ARN peut être déterminée. A 280nm, la concentration en ribosomes d'ARN et d'histones accrochés à l'ADN peut être déterminée. En calculant le ratio 260/280, la qualité des ARN extraites peut être exprimée. Afin que les résultats de l'expérience soient significatifs, il faut travailler sur une même quantité d'ARN (1µg) pour cela le volume à prélever dans les solutions est calculé. (Exemple du contrôle : une mesure au spectrophotomètre indique qu'il y a 15.16 µg d'ARN pour 1 ml. [...]