Régulation de l'expression de la phosphatase alcaline chez E. Coli

Thèmes abordés

Régulation de l'expression des gènes, phosphatase alcaline, régulon phosphate

Résumé du document

La phosphatase alcaline (EC3.1.3.1) est une enzyme qui catalyse l'hydrolyse des groupements phosphates de plusieurs types de molécules telles que les nucléotides, les protéines et les alcaloïdes. Ce processus est appelé déphosphorylation et aboutit à la libération d'un phosphate inorganique. Cette activité se fait à un pH alcalin. L'objectif de ces travaux pratiques est d'étudier la régulation de l'expression de la phosphatase alcaline codée par le gène PhoA, chez la bactérie Escherichia Coli.

Pour cela, une concentration en phosphate croissante sera présente dans les milieux de culture des bactéries. Sachant que la réaction catalysée par la phosphatase alcaline permet la libération d'un phosphate inorganique dans le milieu de culture, il semblerait probable que cette molécule exerce un rétrocontrôle sur l'expression de l'enzyme.

Cette expression sera étudiée à deux niveaux différents :
Au niveau transcriptionnel par la méthode de RT-qPCR (Reverse Transcriptase quantitative Polymerisation Chain Reaction) sur l'ARNm du gène PhoA.
Au niveau traductionnel et post-traductionnel par la méthode de mesure de l'activité enzymatique de la phosphatase alcaline.
Ces deux expérimentations permettront donc de conclure sur la régulation de l'expression de la phosphatase alcaline induite par le phosphate.

Extraits

[...] Régulation de l'expression de la phosphatase alcaline chez E. Coli Introduction La phosphatase alcaline (EC ) est une enzyme qui catalyse l'hydrolyse des groupements phosphates de plusieurs types de molécules telles que les nucléotides, les protéines et les alcaloïdes. Ce processus est appelé déphosphorylation et aboutit à la libération d'un phosphate inorganique. Cette activité se fait à un pH alcalin. L'objectif de ces travaux pratiques est d'étudier la régulation de l'expression de la phosphatase alcaline codée par le gène PhoA, chez la bactérie Escherichia Coli. [...]

[...] Une légère augmentation (entourée en rouge) apparaît pour la concentration en phosphate de 64 µg/mL. Elle est due à une erreur de manipulation lors de la lecture au spectrophotomètre : phase organique et chloroforme ont été mélangés avant la lecture de DO. Ces observations nous confortent quant à l'effet du phosphate sur l'expression de la phosphatase alcaline. Une forte concentration en phosphate va donc inhiber l'activité enzymatique. Cette diminution peut s'expliquer par deux hypothèses : l'absence de la protéine ou sa présence sous forme inactive. [...]

[...] Figure 2 : Variation de l'activité spécifique de la phosphatase alcaline en fonction des concentrations en phosphate. Discussion Après extraction des ARNs, le calcul de leur concentration dans chaque échantillon (Tableau a permis de s'assurer de la qualité de l'extraction avant de réaliser la RT-PCRq. L'analyse par RT-PCRq a permis de déterminer la quantité relative d'ARNm codé par le gène PhoA en fonction de la concentration en phosphate (Figure 1). Pour cette analyse, la culture bactérienne sans phosphate a servi de contrôle négatif à l'effet du phosphate sur l'expression de la phosphatase alcaline. [...]

[...] Une solution de DNAse est ensuite ajoutée sur la membrane afin de dégrader les ADNs. Cette solution contient du Yellow core buffer, de la DNAse I et du MnCl2 qui permet d'activer la DNAse. Le Yellow core buffer contient un colorant jaune et des sels, ce qui permet de vérifier la présence de la solution de DNAse sur toute la membrane. Une solution de SV DNAse stop est alors ajoutée après quelques minutes d'incubation, afin de stopper l'action de la DNAse puis la membrane est lavée plusieurs fois avec une solution SV RNA Wash. [...]

[...] Les ARNs extraits sont soumis à une RT-PCR quantitative dont la première étape est la transcription inverse. Il s'agit de la synthèse d'un brin d'ADN à partir d'une matrice ARN grâce à une ADN polymérase ARN dépendante appelée transcriptase inverse. Des molécules d'ADNc sont donc obtenues à partir des molécules d'ARN présentes dans les échantillons, dont celles des gènes phoA et 16S. Une PCR quantitative en temps réel est ensuite réalisée sur les ADNc obtenus, avec des amorces spécifiques aux gènes phoA et 16S, une Taq polymérase, des nucléotides, de l'ATP et du SYBR Green. [...]