Rapport de TP : détection de levures de la famille des Saccharomyces dans la bière biologique

Résumé du document

Au cours de ce TP nous avons rencontré deux levures de référence : Saccharomyces cerevisiae qui est une levure à bourgeon, et Schyzosaccharomyces pombe, levure à fission. Elles nous ont été utiles lors de la détection de micro-organismes en milieu complexe, en l'occurrence, de la bière biologique. Nous nous sommes alors posé deux questions :
- détecte-t-on des levures dans ces bières ?
- si oui, s'agit-il de levures appartenant à la famille Saccharomyces? Question à laquelle l'hybridation in situ nous permettra de répondre.

Extraits

[...] Nous observons des Saccharomyces, puisqu'il y a bien marquage au Cy3, donc hybridation spécifique de la sonde ITS1. Au DAPI des zones du noyau semblent moins marquées : il s'agit du nucléole. Fig.3 : RGB merge de S.cerevisiae Sur la figure les deux images précédentes ont été superposées : on peut observer le phénotype arrondi des Saccharomyces cerevisiae, un fort marquage rouge du nucléole et le cytoplasme en rouge plus estompé. En bleu, remarquons un marquage complémentaire au nucléole, qui correspond au nucléoplasme (Fig.4). [...]

[...] Conclusion Lors du TP, nous avons pu vérifier la spécificité de la sonde pour les Saccharomyces, ainsi que la pertinence du protocole face à des souches de levures sauvages (bière biologique). Nous nous étions en effet demandé si le protocole serait adapté à des levures dont nous ne connaissions pas l'état de la paroi. Le marquage a fonctionné, le protocole utilisé peut donc être proposé en routine pour ce TP. Les images ont été acquises en microscopie numérique (caméra CCD), puis visualisées, traitées et analysées avec le logiciel ImageJ. [...]

[...] La FISH est une méthode qui présente de nombreux avantages : elle est objective (l'hybridation a lieu ou non ; il n'y a pas d'interprétation du manipulateur), elle est robuste, sa reproductibilité est impressionnante Elle possède toutefois quelques inconvénients : elle est longue et ne permet pas d'identifier l'ensemble des micro-organismes en présence (seulement ceux qui s'hybrident avec la sonde, donc auxquels on s'attendait). Ainsi, en diagnostic microbiologique, il apparaît difficile de proposer cette méthode comme premier choix, mais elle est excellente par exemple pour les généticiens, notamment pour permettre la localisation chromosomique de gènes. [...]

[...] Figure on peut compter 4 Schyzosaccharomyces pombe, sans que cela ne nécessite le passage par une binarisation de l'image. Le phénotype allongé des cellules est caractéristique de Schyzosaccharomyces pombe. Le marquage au Cy3 n'étant pas significatif, j'ai choisi de ne pas réaliser un RGB merge mais simplement de faire apparaître le marquage au DAPI en bleu (Fig.9). Fig.9 : Marquage des Schyzosaccharomyces pombe au DAPI en microscopie à fluorescence : agrandissement du noyau d'une des levures Chez l'Homme chromosomes portent des loci où se trouvent les gènes codant pour les ARNr, chez Saccharomyces cerevisiae, il n'y a qu'un site correspondant, chez Schizosaccharomyces pombe, on en trouve deux. [...]

[...] - si oui, s'agit-il de levures appartenant à la famille Saccharomyces ? Question à laquelle l'hybridation in situ nous permettra de répondre. Design de la sonde, et marquage des cellules Une sonde hybridant ITS1, séquence du préARN ribosomique spécifique de l'espèce Saccharomyces, a été réalisée. Cette sonde s'hybride sur environ 50 nucléotides de l'ITS1 présent durant plusieurs étapes de maturation du préARNr : on la retrouve dans le nucléole (35S, 32S et 20S), ainsi que dans le cytoplasme (20S). La sonde est marquée au Cy3, et permet donc de visualiser le nucléole (plus faiblement, le cytoplasme) en rouge sur les photographies en couleur qui suivent, chez les levures Saccharomyces. [...]