Rapport génétique - Extraction d'ADN plasmidique et digestion de l'ADN

Thèmes abordés

SIBIOC Sciences de l'Ingénieur Industriel Biochimie, agrobiosciences, chimie, spectrophotométrie, ADN Acide désoxyribonucléique, plasmide, génétique, électrophorèse, ADN plasmidique

Résumé du document

Le but de cet exercice est d'extraire l'ADN contenu dans le plasmide peGFP, le purifier et vérifier sa pureté avec les rapports 260/280 et 260/230 obtenus par spectrophotométrie.

Extraits

[...] Le matériel génétique et l'ensemble du contenu de la cellule sort et se retrouve en solution. La solution II contient également du NaOH qui dénature l'ADN en brisant les liaisons hydrogènes entre les bases liant les deux brins d'ADN. La solution III est une solution acide qui permet de neutraliser les molécules de NaOH. Les liaisons hydrogènes peuvent se reformer entre les bases des brins d'ADN. Cependant ce rappariement ne s'effectue pas de la même manière pour les brins d'ADN provenant des plasmides et pour ceux provenant des chromosomes. [...]

[...] Parmi celles-ci, une bande à 588 nucléotides et une à nucléotides qui sont proches des bandes théoriques du plasmide peGFP. BamHI et PvuII Pour la combinaison des enzymes BamHI et PvuII comme il y a eu des bandes supplémentaires précédemment, cela entraine également un grand nombre de bandes pour cet échantillon. Théoriquement, on devrait obtenir 3 bandes à et 3262 nucléotides. Il y a 8 bandes intenses, parmi celles-ci, une bande à 715 et à nucléotides. Il y a également de nombreuses bandes peu intenses. Il est difficile d'être précis à cause du nombre de bandes sur le gel. [...]

[...] Comme le marqueur EZ500 donne des résultats plus proches, j'ai choisi de me fier à ce marqueur pour la suite de l'analyse. ADN non digéré Pour l'échantillon correspondant à l'ADN non digéré bandes de migration importantes sont visibles. Contrairement aux échantillons précédents, on ne voit qu'une très faible bande aux alentours de paires de base. C'est normal car l'ADN est sous forme circulaire et ne migre donc pas à la même vitesse que l'ADN linéaire. Cela confirme que la reformation de l'ADN circulaire lors des étapes de purification a bien fonctionné. [...]

[...] Pour EcoRI et BamHI, on s'attend à avoir un fragment de nucléotides car ces enzymes n'effectuent qu'un clivage dans le plasmide peGFP. PvuII reconnait deux sites de restriction sur cet enzyme, la taille des fragments est de 608 et nucléotides. Une combinaison de BamHI et PvuII entraine le clivage du plasmide en 3 fragments de et nucléotides. Électrophorèse On effectue une électrophorèse sur gel d'agarose Pour cela, on prépare une solution d'agarose que l'on coule dans une cuve d'électrophorèse. À l'une des extrémités, on introduit un peigne qui permet de former des puits lors de la solidification du gel. [...]

[...] Rapport génétique - Extraction d'ADN plasmidique et digestion de l'ADN But Extraire l'ADN contenu dans le plasmide peGFP, le purifier et vérifier sa pureté avec les rapports 260/280 et 260/230 obtenus par spectrophotométrie. Effectuer différentes digestions sur l'ADN plasmidique avec des enzymes de restriction et réaliser une électrophorèse à partir de ces échantillons. À partir des résultats de l'électrophorèse, vérifiez s'il s'agit du plasmide peGFP ou d'un autre plasmide. Principe Le plasmide est de l'ADN circulaire double brin de quelques milliers de paires de base que l'on retrouve dans les cellules procaryotes. [...]