Quantification et identification de microorganismes dans des échantillons environnementaux

Thèmes abordés

Coloration de Gram, PCR 16S, culture sur gélose, extraction de l'ADN, séquençage automatique de Sanger, RFLP, BLAST

Résumé du document

Ce compte rendu traite de la quantification et de l'identification de micro-organismes dans des échantillons d'eau et de terre environnementaux. Pour cela, les techniques de culture sur gélose, de coloration de Gram, de PCR 16S , de séquençage automatique de Sanger sur les fragments amplifiés par PCR 16S et de RFLP ont été utilisées.
Les résultats de séquençage ont ensuite été comparés sur l'outil BLAST pour identifier les micro-organismes.

Extraits

[...] PCR ciblant le gène codant pour l'ARNr 16S Cette amplification a été effectuée sur les ADNs extraits à partir des colonies isolées et sur ceux extraits à partir des échantillons environnementaux. Des mélanges PCR ont été réalisés pour chaque échantillon avec 4 µL de tampon de charge coloré en vert µL de dNTPs (désoxyribonucléotides, à 8 mM final) µL de chaque amorce µM final) µL de l'enzyme Go Taq polymérase U/µL) µL de l'ADN extrait et 8,9 µL d'eau, pour chaque tube. [...]

[...] Ce volume étant très faible par rapport au volume total de l'échantillon ce n'est pas représentatif de la diversité en microorganismes que ce dernier peut contenir. De plus, les bactéries sont difficiles à observer avec un grossissement X400 et il est difficile de les discriminer de végétaux ou d'autres organismes. Pour l'échantillon de surnageant provenant de la décantation de terre dans de l'eau, le nombre de bactéries a été évalué à l'aide d'une lame FastRead. Il a été estimé un nombre compris entre 1000 et 10000 microorganismes par grille. [...]

[...] Les séquences modifiées obtenues pour ces deux échantillons sont présentées en Annexe 1. Ces séquences ont alors été soumises à une analyse de génomique comparative grâce à l'utilisation de l'outil nucleotide BLAST du site NCBI, en interrogeant la base de données Nucleotide Collection (nr/nt). Cette analyse permet de conclure que le fragment d'ADN de l'échantillon RA est homologue au fragment d'ADN du gène codant pour l'ARNr 16S des bactéries du genre Sphingomonas avec une E-value de un score maximal de 1177, un query coverage de 99% et un maximum d'identité de 97%. [...]

[...] Quantification et identification de microorganismes dans des échantillons environnementaux Introduction Les microorganismes représentent l'essentiel de la diversité biologique environnementale. Ils sont présents dans la terre, l'eau, l'air et les sédiments. Par exemple, un gramme de sol contient en moyenne un milliard microorganismes représentant probablement plusieurs milliers d'espèces. Ces organismes exercent des fonctions importantes au sein des écosystèmes les contenant. Ils interviennent notamment dans les cycles biogéochimiques d'éléments majeurs tels que le carbone, l'azote et le soufre. Dans des zones sans lumière, les bactéries chimio-autotrophes peuvent fournir l'énergie nécessaire à la survie d'autres organismes et même créer une symbiose avec des organismes hétérotrophes. [...]

[...] De plus, ces colonies présentent les mêmes caractéristiques que celles décrites pour la Figure 1. La culture des différents échantillons environnementaux a donc donné des résultats probants. Ces échantillons sont riches en microorganismes, de nombreuses colonies ayant été observées après incubation. Ces colonies représentent les espèces bactériennes cultivables majoritaires présentes dans les échantillons environnementaux. La présence de colonies isolées a permis d'effectuer des prélèvements afin d'identifier les bactéries majoritaires présentes dans les différents échantillons. Les colonies isolées observées ont été utilisées pour la suite des expériences. [...]