Purification du lysozyme à partir d'un blanc d'oeuf

Résumé du document

The objective of the manipulation was to purify lysozyme from egg white. To do this we have first extract the protein from the egg white by filtration and dilution followed by three successive centrifugal in which the supernatant was recovered in order to be centrifuged. Enzymatic tests have been carried out on each of the supernatants in order to determine the enzymatic activity of each samples (F0 to F4). Spectrophotometers analysis revealed that that the enzymatic activity of F4 is much higher (6958 umol.L-1.min-1) than F3 ( 5600umol.L-1.min-1). The extract F4 is therefore more pure than F3. With regard to F0 it has a high enzymatic activity (36200umol.L-1.min-1 ) not purified it contains a large set of proteins. Measurement of absorbance at 700nm of BSA as a function of protein mass (mg) revealed that the total amount of protein present in the white egg is 192mg. Determination of enzyme yields of F3 amounts to 15,47, this yield is less efficient than F4 ( 19,22 ). This is an argument in favor of F4 which claims that this extract is of higher purity. Furthermore the specific activity of F3 is below (1,98) compare to F4 (2,93) as well as the purification factor ( 0,33 for F3 and 0,55 for F4) .

Extraits

[...] Determination of enzyme yields of F3 amounts to 15,47, this yield is less efficient than F4 ( 19,22 This is an argument in favor of F4 which claims that this extract is of higher purity. Furthermore the specific activity of F3 is below compare to F4 as well as the purification factor ( 0,33 for F3 and 0,55 for F4) . Introduction : Le lysozyme également appelé muramidase est une protéine globulaire longue d'une centaine d'acides aminés qui est impliquée dans la défense contre les infections bactériennes. [...]

[...] Ce qui permet de réaliser une purification du lysozyme en rendant insolubles la plupart des protéines de blanc d'œuf. La purification consiste alors à extraire le lysozyme du blanc d'œuf par chromatographie échangeuse d'ions négatifs pour ensuite de suivre les différents états de purification par mesure de l'activité. La purification s'effectue en trois étapes : oo Une phase d'absorption qui s'effectue avec un tampon a pH=10, car à ce pH le lysozyme est chargé positivement alors que les autres protéines de plus faibles pHi sont chargées négativement. [...]

[...] Abstract : The objective of the manipulation was to purify lysozyme from egg white. To do this we have first extract the protein from the egg white by filtration and dilution followed by three successive centrifugal in which the supernatant was recovered in order to be centrifuged. Enzymatic tests have been carried out on each of the supernatants in order to determine the enzymatic activity of each samples (F0 to F4). Spectrophotometers analysis revealed that that the enzymatic activity of F4 is much higher (6958 umol.L-1.min-1) than F3 ( 5600umol.L-1.min-1). [...]

[...] On a alors pu vérifier toutes ces informations grâce au calcul du facteur de purification qui nous a alors bien montrer que F4 ayant pour facteur de purification 16,28 était plus purifiée que F3 qui a pour facteur de purification 11. Conclusion : La centrifugation est une méthode efficace pour la purification des enzymes ; grâce aux différentes unités de mesures : l'activité enzymatique, l'activité spécifique ou le facteur de purification ; on peut déterminer le nombre de fois qu'une solution a été purifié ainsi que son rendement. [...]

[...] F0 F1 F2 F3 F4 Volume totale en mL Volume testé en uL ΔAbs/min AE essai en umol.L-1.min- AE total en umol.L-1.min- Résultats : * Détermination de l'activité enzymatique AEtotal=AEessaixVtotalVtesté Pour F0 : * A 50 uL : AEtotal=181x5.10-350.10-6=18100 umol.L-1.min-1 Pour F3 : * A 300 uL : AEtotal=210x8.10-3300.10-6=5600 umol.L-1.min-1 Pour F4 : * A 300 uL : AEtotal=167x12,5.10-3300.10-6=6958 umol.L-1.min-1 * Détermination de la masse en protéines [Fig.1] : Graphique représentant l'absorbance à 700nm de BSA en fonction de la masse de protéines en mg L'équation de la droite de la courbe représentant l'absorbance à 700nm de BSA en fonction de la masse de protéine en ug est : y=0,0019x+0,0003 Donc à partir de cette équation, on peut déterminer la masse de protéines contenue dans chaque essai mprotéines=Abs700nm0,0019+0,0003 Pour F0 : mprotéines=0,729+0,00030,0019=383,84ug Pour calculer la masse totale de protéine on réalise le calcul suivant : mtotale protéine=VtotalxmprotéinesVtesté Pour F0 : mtotale protéine=5x383,8420.10-3=95960ug F0 F1 F2 F3 F4 Volume total en mL Volume testé en uL Absorbance à 700 nm Masse de protéine dans essai en ug Masse totale de protéines en ug * Détermination du rendement de l'activité enzymatique Le rendement de l'activité enzymatique est égale à : activité enzymatique après purificationactivité enzymatique avant purificationx100 Pour F3 : R=AEtotalAEessaix100=560018100x100=30,94 F0 F1 F2 F3 F4 AE total en umol.L-1.min- Rendement en * Détermination de l'activité spécifique L'activité spécifique est égale à : activité enzymatique masse totale des protéines Pour F3 : AS=AEmtotal=56002825=1,98umol.L-1.min-1.ug-1 F0 F1 F2 F3 F4 AE total en umol.L-1.min- Masse totale de protéines en ug Activité spécifique en umol.L[-1].min[-1].ug[-1] * Détermination du facteur de purification Le facteur de purification correspond à : ASaprès purificationASavant purification Pour F3 : FP=ASaprès purificationASavant purification=1,980,18=11 F0 F1 F2 F3 F4 Activité spécifique en umol.L[-1].min[-1].ug[-1] Facteur de purification Discussion : Grâce à la spectrophotométrie on a pu déterminer la masse totale de protéine que l'on avait dans notre solution, et donc de la comparer à la masse de protéine que l'on trouve en général dans un blanc d'oeuf. En effet, l'étude de chaque essai nous a permis de déterminer l'absorbance de la solution qui varie en fonction de sa concentration, et donc avec la loi de Beer Lambert de trouver la masse de protéines. [...]