Le polymorphisme de l'ADN

Résumé du document

L'apolipoprotéine B est l'une des lipoprotéines impliquées dans le transport des lipides dans le sang. Plus précisément, elle agit sur le transport et le dépôt du cholestérol au niveau des parois des artères. Elle serait donc potentiellement responsable du développement de maladie cardio-vasculaire. L'apolipoprotéine B présente un polymorphisme au niveau du site EcoR1. Le site de cette enzyme de restriction se trouve au niveau du codon 4154, dans la séquence du gène de l'apolipoprotéine B, situé sur le chromosome deux. Ce codon peut subir une mutation qui fait disparaître le site EcoR1 : le codon GAA (acide glutamique, E) devient AAA (lysine, K).

Extraits

[...] Le marqueur de poids moléculaire est déposé dans l'un des autres puits. Le gel est placé verticalement dans le tampon, puis une différence de potentiel est appliquée. Après la migration, le gel est coloré avec du BET, puis décoloré et photographié sous UV. Description des résultats Chacun des dépôts dans les différents puits a migré à des distances différentes. Grâce aux marqueurs de poids moléculaire dont nous connaissons la taille, nous pouvons comparer nos échantillons à ces derniers pour connaître les tailles de nos fragments d'ADN. [...]

[...] Le tampon : sert à maintenir stable le pH du milieu réactionnel au niveau optimal pour la Taq polymérase et contient des ions Mg et des cofacteurs indispensables pour la réaction de polymérisation avec la Taq polymérase. De plus il sert à maintenir stable les hybrides ADN/ARN. La Taq ploymérase : enzyme issue des bactéries vivant en source chaude, capables de croître et se reproduire dans l'eau à 70°C. Thermocycleur : permet d'exposer les tubes à des températures choisies et pour des durées déterminées. Après avoir préparé notre ADN extrait on prépare les tubes destinés à la PCR. D'après les données fournies dans l'énoncé, nous pouvons calculer les volumes à mettre dans chaque tube. [...]

[...] Cet photo correspond donc à des résultats qui nous ont été distribuées. et : Témoin (marqueur de poids moléculaire) Individu 1 : : PCR2 / : PCR2 + EcoR1 Individu 2 : : PCR2' / : PCR2' + EcoR1 : témoin négatif Extrait HepG2 : Extrait HepG2 : : PCR3 : PCR3' / / : PCR3 + EcoR1 : PCR3' + EcoR1 Interprétation Pour tous les puits contenant les produits de PCR non-digérés, il est normal de n'observer qu'une seule bande, car l'ADN n'a pas été découpé par l'enzyme. [...]

[...] Pour cela on diminue la température à 55°C. Pour déterminer cette température on calcul la proportion de A + T et de C + G. Tm= Pour APOB1 : Tm = 2 x 11 + 4 x 9 = 58°C Pour APOB2 : Tm = 62°C La température d'hybridation doit être inférieure à la Tm la plus faible. Enfin l'élongation : on augmente la température à 72°C afin que la Taq polymérase puisse fonctionner et donner des nouveaux brins amplifiés. [...]

[...] L'apolipoprotéine B présente un polymorphisme au niveau du site EcoR1. Le site de cette enzyme de restriction se trouve au niveau du codon 4154, dans la séquence du gène de l'apolipoprotéine situé sur le chromosome deux. Ce codon peut subir une mutation qui fait disparaître le site EcoR1 : le codon GAA (acide glutamique, devient AAA (lysine, K). Le but de se TP est d'étudier le polymorphisme du gène de l'apolipoprotéine c'est-à-dire de pouvoir déterminer l'hétérozygotie ou l'homozygotie pour ce gène à partir d'ADN génomique HepG2 et à partir d'ADN extrait de nos propres cellules épithéliales de la cavité buccale. [...]