Mise en évidence de la neurogénèse et de la gliogénèse dans un cerveau de souris adulte

Résumé du document

Nous avons pour objectif de démontrer que de nouveaux neurones et de nouvelles cellules gliales sont générées dans le cerveau tout au long de la vie de l'individu.
Le principe repose sur deux grandes étapes :
- Tout d'abord, utilisation du marqueur de prolifération cellulaire BrdU pour démontrer l'existence de divisions des cellules souches au sein du cerveau.
- Ensuite, des techniques permettant de retrouver des neurones et cellules gliales marqués, issus des cellules souches, pour les différencier entre eux : colorations et immunomarquages.

Extraits

[...] Conclusion On se base sur le double marquage des cellules gliales pour montrer la neurogénèse et la gliogénèse : - Si on observe une une coloration rouge (correspondant au BdrU) superposant une coloration verte (correspondant aux cellules gliales), on peut en déduire que ces cellules gliales sont néoformées. - Si, au contraire, on observe une coloration rouge en dehors de l'espace délimité par une cellule gliale, on peut supposer que le BrdU se trouve dans un neurone néoformé. Cela nous permet de mettre en évidence la gliogénèse et la neurogénèse. D'après les connaissances scientifiques actuelles, l'hippocampe et la région sous-ventriculaire sont les zones de neurogénèse et de gliogénèse, observables par nos différentes colorations. [...]

[...] Conservation des tissus On conserve le cerveau dans du PAF (paraformaldéhyde) qui est un fixateur de structures biologiques, pendant 2 à 3 jours. Suite à un lavage au PBS, le cerveau est mis dans du sucrose, pour éviter une cristallisation lors de la congélation Coupes du cerveau On utilise un cryotome pour faire des coupes fines de 40µm Montage sur lames III Coloration au crésyl violet 1. Principe de la coloration Le crésyl violet colore les noyaux et les corps de Nissl (REG) des neurones. [...]

[...] Certaines lames ne contiennent que de l'anticorps secondaire, ce sont les lames contrôles. Elles permettent de s'assurer de la spécificité anticorps/antigène. En effet, sans anticorps primaire, l'anticorps secondaire ne peut pas se fixer au GFAP, d'où une absence de coloration verte Marquage au BrdU Le principe est le même que pour les cellules gliales, avec cependant quelques différences : - l'anticorps primaire est dirigé contre le BrdU - l'anticorps secondaire est couplé à un fluorochrome qui émet une autre couleur que le vert (par exemple : rouge) . [...]

[...] Comme nous allons procéder au marquage des cellules gliales et d'autre part du BrdU, il faut éviter les réactions croisées. Pour cela, il faut que les anticorps proviennent de deux animaux différents Marquage des cellules gliales La protéine GFAP est une protéine spécifique des astrocytes. De même MAG est une protéine spécifique des oligodendrocytes. Le marquage effectué ici consiste à observer des astrocytes, d'où l'utilisation d'anticorps primaire anti-GFAP. On utilise une solution de BSA (Bovine Sérum Albumine) + Triton + PBS pour bloquer les sites non spécifiques et permettre une perméabilisation des membranes. [...]

[...] Le BrdU peut être incorporé lors de la réplication, dans l'ADN nouvellement synthétisé (durant la phase S du cycle cellulaire), en remplaçant la thymidine Matériel et méthodes On procède à une injection, sur souris vivante adulte, d'une quantité X de BrdU en intrapéritonéale. Cela semblerait être la voie la plus sûre pour une diffusion vers le cerveau. Nous attendons un temps X (non défini) correspondant au temps minimum de la division neuronale supposée. On peut renouveler l'administration du nucléoside marqué plusieurs fois de suite, sachant qu'in vivo, ce marqueur est éliminé au bout de deux heures : marquage cumulatif. II Dissection et coupe du cerveau 1. [...]