Métabolisme glucidique : étude de l'alcool déshydrogénase

Thèmes abordés

Métabolisme glucidique, étude de l'alcool déshydrogénase, Saccharomyces cerevisiae, enzyme, gamme étalon, facteur de dilution, loi de Beer-Lambert, activité ADH, méthanol

Résumé du document

Dans ce TP nous allons étudier l'activité de l'ADH (Ethanol-NAD+-oxydoréductase, EC 1.1.1.1) suivant divers facteurs. Cette enzyme permet la détoxification de l'éthanol chez les mammifères. Dans le cadre du TP l'ADH étudié provient Saccharomyces cerevisiae (levure), c'est un tétramère composé de 4 sous-unités identiques, chacune contient 2 atomes de Zinc (Zn2+) stabilisant la structure tertiaire de l'enzyme. Le pH optimal de l'ADH est pH = 8,8.

Les facteurs qui seront étudiés dans ce TP sont l'activité de l'ADH en fonction de la concentration en éthanol, sa spécificité vis-à-vis des substrats et des cofacteurs, l'influence de l'orthophénanthroline sur l'enzyme et enfin la thérmodénaturation de l'ADH.

Extraits

[...] Il y a eu plus de produit formé et donc de réactions lors de l'expérience les résultats de l'expérience 2 sont similaires à ceux avec absence de substrats. Lorsque l'enzyme est placée à 75 degrés ont dit qu'elle subit une dénaturation, c'est-à-dire un changement de conformation, de ce fait son affinité avec le substrat diminue voire devient nulle. On peut donc en déduire que lors de l'expérience 1 l'éthanol aurait protégé l'enzyme en la stabilisant et en empêchant sa dénaturation lors de l'incubation à 75 degrés tandis que lors de l'expérience 2 le NAD+ n'aurait pas aidé à ne pas dénaturer l'enzyme, car le résultat est le même que celui en absence de substrats. [...]

[...] Activité ADH et spécificité des substrats et des cofacteurs On prépare 12, chaque tube impair sert à faire le blanc pour le reste on modifie le substrat introduit Résultats : Calcul de la concentration en NADH pour chaque tube grâce à la loi de Beer- Lambert C = A / ε * l : Avec l = 1 cm et ε = 4903,75 L.mol-1.cm-1 Tube 1 : C = 0,163 / 4903,75 = 3,32 .10-5mol. L-1 Tube 2 : C = 2,16 .10-5mol. L-1 Tube 3 : C =3,46 .105mol. L-1 Tube 4 : C = 6,53 .10-5mol. Tube 5 : C = 3,02 .10-5mol. L-1 Tube 6 : C = 1,73 .10-5mol. [...]

[...] Thérmodénaturation de l'ADH -Absence des substrats : Préparation de 4 tubes. On mesure l'absorbance de chaque tube : On observe que plus le temps d'incubation du tube est important plus quantité de NADH produit est basse et donc moins il y a de réactions. Chauffée à 75 degrés l'enzyme est dénaturée, c'est-à-dire qu'elle change de conformation, de ce fait son affinité avec le substrat diminue voir devient nulle et la réaction ne peut plus être réalisée. Calcul de la concentration en NADH pour chaque tube grâce à la loi de Beer- Lambert C = A / ε * l : Avec l = 1 cm et ε = 4903,75 L.mol-1.cm-1 Tube 1 :C=0,147/4903,75=2,99 .10-5mol/L Tube 2 : C = 2,59 .10- 5mol/L Tube 3 : C = 2,04 .10-5 mol/L Tube 4 : C = 1,55 .10-5mol/L -Présence de substrat Pour ce cas-ci, nous allons réaliser 2 expériences au cours desquels nous inverserons l'ordre d'ajout de l'éthanol et du NAD+ après l'incubation Expérience 1 : Préparation de 4 tubes. [...]

[...] Métabolisme glucidique : étude de l'alcool déshydrogénase Dans ce TP, nous allons étudier l'activité de l'ADH (Ethanol-NAD+- oxydoréductase, EC ) suivant divers facteurs. Cette enzyme permet la détoxification de l'éthanol chez les mammifères. La réaction catalysée par cette enzyme est la suivante : Dans le cadre du TP l'ADH étudié provient Saccharomyces cerevisiae (levure), c'est un tétramère composé de 4 sous-unités identiques, chacune contient 2 atomes de Zinc stabilisant la structure tertiaire de l'enzyme. Le pH optimal de l'ADH est pH = 8,8. [...]

[...] Gamme étalon Pour suivre l'activité de l'ADH, on va doser le NADH formé suite à la réaction. Plus l'absorbance est grande et plus la quantité de NADH formée est importante ce qui signifie qu'il y a eu réaction. Résultats : Pour réaliser la gamme étalon, nous avons besoin de calculer le facteur de dilution : On convertit les unités en mol/L pour la concentration et en L pour les volumes. Ci * Vi = Cf * Vf ↔ Cf = (Ci * Vi) / Vf Pour le tube 2 : (0,002 * 2.10 / = 4.10 -5M La concentration finale du tube 2 est de 4.10 -5mol/L Tube 3 = 8.10 -5mol/L Tube 4 = 1,2 .10-4mol/L Tube 5 = 1,6 .10-4mol/L Tube 6 = 2.10 -4mol/L Loi de Beer-Lambert : A = ε * l * C ↔ ε = A / C * l Avec l = 1 cm et C en NADH en mol/L Calcul de ε pour chaque tube, nous ferons la moyenne pour obtenir le coefficient ε : Tube 2 : ε = A / C ↔ 0,185 / 0,00004 = 4625 L.mol-1.cm-1 Tube 3 : ε = 5125 L.mol-1.cm-1 Tube 4 : ε = 4975 L.mol-1.cm-1 Tube 5 : ε=4643,75 L.mol-1.cm-1 Tube 6 : ε = 5150 L.mol-1.cm-1 Moyenne ε = 4903,75 L.mol-1.cm-1 II. [...]