Extraction, purification et détermination des constantes cinétiques d'une enzyme : le Lysozyme

Thèmes abordés

Science pour la santé, lysozyme, enzyme, purification, extraction, centrifugation, constantes cinétiques, chromatographie échangeuse d'ions, nicrococcus lysodeikticus

Résumé du document

Les enzymes sont des protéines présentes dans les cellules permettant de faciliter les réactions chimiques qui s'y produisent. Parmi ces enzymes, on retrouve les lysozymes. Ils sont naturellement présents dans l'organisme, notamment dans les sécrétions et les fluides corporels tels que la salive, les larmes et la sueur. Cette enzyme est également présente dans les aliments, on peut la trouver dans le lait de vache, le miel, les blancs d'oeufs. Il est aussi trouvé dans certaines cellules du système immunitaire, comme les macrophages.
La fonction principale du lysozyme est de détruire les parois cellulaires des bactéries. Il agit en catalysant la dégradation du peptidoglycane, une composante essentielle de la paroi cellulaire bactérienne. La lyse se fait par hydrolyse des liaisons Bêta entre l'acide N-acétylmuramique et la N-acétylglucosamine qui sont les constituants du peptidoglycane. En provoquant la rupture de ces parois, le lysozyme aide à défendre l'organisme contre les infections bactériennes. En raison de ses propriétés antibactériennes, le lysozyme a des applications médicales potentielles. Il a des effets antimicrobiens et anti-inflammatoires.

Extraits

[...] Représentation de Michaelis-Menten : Afin d'obtenir un meilleur graphique, on enlève un point de la courbe. on obtient donc le graphique suivant : Représentation de Lineweaver-Burk : De même, afin d'obtenir un meilleur résultat, on enlève deux points de la courbe : Détermination de KM et Vmax: 1/vi = Km/Vmax​​ ⋅1/[S]​+1/Vmax​ On a une équation de type y = ax+b donc 1/Vmax = 1,7 soit Vmax = 1/1,7 = 0,588 g.L[-1].min[-1] donc Km/Vmax = 0,0177 soit Km = 0,0177 x0,588 = 0,0104g.L[-1] Manipulations : Lors de nos manipulations, nous avons utilisé des pipettes automatiques, une colonne avec de la Cellulose, placée en centrifugeuse au préalable ; des tampons à différents pH et à différentes forces ioniques et la bactérie Micrococcus lysodeikticus, qui est une bactérie présente naturellement sur notre peau ; tout ce que nous avons utilisé et manipulé sont des sources d'erreurs possibles. [...]

[...] Il est donc nécessaire de bien mélanger/agiter le flacon contenant la solution afin de permettre la re-suspension des bactéries dans la solution. L'oubli de l'agitation avant prélèvements est, là encore, une source d'erreur dans les résultats puisqu'il est possible qu'aucune des solutions dans lesquelles on ait ajouté de la bactérie n'en contiennent réellement. Il est nécessairement important de conserver toutes les fractions supposées contenir des protéines dans la glace, afin d'éviter une réaction indésirable avec un autre substrat, une contamination mais également pour conserver l'enzyme. [...]

[...] Extraction, purification et détermination des constantes cinétiques d'une enzyme : le Lysozyme Les enzymes sont des protéines présentes dans les cellules permettant de faciliter les réactions chimiques qui s'y produisent. Parmi ces enzymes on retrouve les lysozymes. Ils sont naturellement présents dans l'organisme, notamment dans les sécrétions et les fluides corporels tels que la salive, les larmes et la sueur. Cette enzyme est également présente dans les aliments, on peut la trouver dans le lait de vache, le miel, les blancs d'œufs. [...]

[...] Nous obtenons le tableau suivant: M F1 F2 F3 E On utilise comme blanc le Tampon A pour l'ensemble des fractions excepté pour la fraction E pour laquelle on utilise le Tampon B comme blanc. On constate une diminution de l'absorbance au cours du temps, cette diminution traduit une activité catalytique. En effet, le lysozyme permet de lyser la paroi des bactéries provoquant ainsi une diminution de l'absorbance. Détermination de la concentration d'activité catalytique dans l'ensemble des fractions: On a : Concentration d'activité catalytique = z / Venzyme Avec z (activité catalytique) = Quantité de substrat / Temps de réaction nsubstrat = Concentrationsubstrat * Volumesubstrat donc z = * / temps On a : z = g/L * 2,5 * / 15 s = 6,67 * mol.s-1 (katal) Donc pour chaque fraction : M b = 6,67 * katal / 220 mL = 3,03*10-7 kat.mL[-1] b = 6,67 * katal / 1,5 mL = 4,44*10-5 kat.mL[-1] b = 6,67 * katal / 9,5 mL = 7,02*10[-6] kat.mL[-1] b = 6,67 * katal / 25,5 mL = 2,61*10[-6] kat.mL[-1] E b = 6,67 * katal / 15 mL = 4,44*10[-6] kat.mL[-1] Les fractions contenant plus ou moins de lysozyme et les raisons de cette présence (ou non) : La fraction M est obtenue après la dilution du blanc d'oeuf, elle contient donc divers composés du blanc d'oeuf, y compris des protéines comme le lysozyme. [...]

[...] On pourrait également vérifier la pureté de l'échantillon avec la chromatographie liquide haute performance. Elle permet la séparation des différentes protéines en fonction de leurs propriétés chimiques. Il faudra ensuite analyser le chromatogramme obtenu, où nous observerons un pic d'élution correspondant à celui du lysozyme (si échantillon pur) Détermination des paramètres cinétiques du lysozyme (Km et Vmax) : Solution Concentration du substrat en g.L- Volume de substrat à 0,4 g.L-1 en μL Volume de Tampon C en μL On prend comme volume final 2,5 mL. [...]