Extraction et carte de restriction d'un ADN plasmidique

Résumé du document

Le principe du clonage consiste à amplifier en un grand nombre de copies une séquence particulière de l'ADN à étudier.
Cet ADN sera ensuite hydrolysé par des endonucléases de restriction, ce sont des enzymes qui coupent l'ADN au niveau des sites de recombinaison.
Les nouveaux fragments ainsi obtenus après cette digestion enzymatique sont ensuite insérés dans un plasmide grâce à une ADN ligase qui catalyse la jonction de deux molécules par de nouvelles liaisons covalentes avec hydrolyse concomitante de l'ATP ou d'autres molécules similaires.
On obtient alors un plasmide recombinant constitué d'une partie plasmidique (vecteur) et une partie d'ADN étranger (insert).
Si celui-ci n'intègre aucun ADN étranger il reste donc sous sa forme d'origine, il est non recombinant. On parle alors de plasmide natif.
Le plasmide recombinant est ensuite injecté dans des bactéries, c'est l'étape de la transformation.
On peut utiliser la méthode du « tri sélectif » afin de retrouver les bactéries transformées en utilisant un milieu sélectif contenant un antibiotique correspondant au gène de résistance porté par le plasmide.
Les bactéries présentes dans ce milieu correspondent à des clones recombinants.
On va ensuite extraire l'ADN plasmidique des clones recombinants puis l'analyser par des endonucléases de restriction.
C'est la technique des mini-preps.
L'ADN extrait est purifié et le positionnement de toutes les séquences reconnues par les endonucléases de restriction permet de réaliser une carte de restriction.

Extraits

[...] On suspend le culot dans 100 µL de solution I puis on vortex et on laisse agir 5 minutes à température ambiante. Puis on ajoute 200 µL de la solution II. On mélange par retournement puis on laisse reposer 5 minutes dans la glace. On ajoute 150 µL de solution III, puis on homogénéise. On laisse de nouveau reposer la solution pendant 5 minutes dans la glace. On centrifuge à 10000g pendant 2 minutes. Enfin on transfère le surnageant dans un tube à centrifuger de 1.5 ml. [...]

[...] On obtient donc une taille du plasmide égal à 3000pb environ. Ensuite, quand on regarde PVUII+DRAI on obtient trois fragments alors qu'avec DRAI seul on obtient 2fragments. On prend PVUII comme étant le point d'origine de la carte de restriction c'està-dire c'est celui qui se trouve aux positions 0 et 3000 à la fois. On va donc trouver DRAI à 430pb de PVUII c'est-à-dire à 2070pb (3000-430) et un autre à 940pb de PVUII étant à 430pb. On a donc deux fragments de DRAI de 700pb et 2300pb. [...]

[...] II) Méthodologie On travaille sur un vecteur seul (pGEM7Zf), sur lequel on réalise une extraction à partir de mini-cultures bactériennes et une carte de restriction. On part d'un bouillon de culture de bactéries JM109. Dans un premier temps, nous avons extrait l'ADN sur 1.5 ml de culture bactérienne selon la technique de Birnboim et Doly . Pour cela nous avons du préparer plusieurs solutions nécessaires à l'extraction ml de solution I - glucose 5 mM - EDTA 0.1 M 10 mM - Tris-Cl 1M 25 mM pH = 8 (glucose) 20% = 200g/L [glucose] i = CM / MM = 200/ 180 = 1.1111 mol/L Soit Ci.Vi = Cf.Vf Vi = ( 50.10 * 1.10 / 1.1111 = 45 µL (EDTA) Ci = 0.1 M Cf = 10mM Vf = 1 ml Soit Ci.Vi = Cf.Vf Vi = ( 0.01 * 1.10 / 0.1 = 100µL Tris-Cl Ci = 1M Cf = 25 mM Vf = 1ml Soit Ci.Vi = Cf.Vf Vi = ( 25.10 1.10 / 1 = 25 µL 1 ml de solution II - NaOH 1M 0.2 N -SDS 10% NaOH Ci = 1M Cf = 0.2 N Vi = ( 0.2 * 1*10-3) / 1 = 200µL SDS [SDS]i = = 10 g/L On réalise une dilution au dixième Ci.Vi = Cf.Vf Vi = * 1.10 / 10 = 100 µL Solution III Acétate de potassium 3M pH= 4.8 Tampon TE -Tris-Cl 1M 10 mM pH=8 - EDTA 0.1 M 1 mM Tris-Cl Cf=10 mM Ci = 1M Vf = 5 ml Vi= ( 10.10 * 5.10 = 50 µL EDTA Cf = 1 mM Ci = 0.1 M Vf = 5 ml Vi = ( 1.10 5.10 / 0.1 = 50µL Lyse des cellules et élimination des protéines On centrifuge 1.5 ml de culture bactérienne pendant 30 secondes à 10000g. [...]

[...] On ajoute 10 µL de la solution d'acide nucléique. On mesure la DO à 260 nm et à 280nm. - Etablissement de la carte de restriction de l'ADN à étudier On procède à la digestion de l'ADN par des endonucléases de restriction selon le protocole suivant : PVU II H2O qsp 25µL ADN µL Tampon 2,5 µL Enzyme µL B 1 DRA I B 1 RSA I P + R + 0,5 P + D B 0,5 + 0,5 R + D + 0,5 On place les tubes 1h30 au bain marie à 37°C . [...]

[...] On verse 30 ml de tampon 10 X dans un bécher, puis on complète par 270ml d'eau distillée. On ajoute alors 50 ml de cette solution préparée à la poudre d'agarose. On fait fondre le tout aux micro-ondes sans faire bouillir. On laisse refroidir la solution jusqu'à une température de 50°C. On verse alors la solution dans l'appareil à électrophorèse après avoir positionné les plaques et le peigne. On laisse solidifier pendant 15 minutes. On ajoute alors le reste du tampon d'électrophorèse 1X. [...]