Etude d'un mécanisme d'action d'une molécule anti-cancéreuse: la bléomycine

Résumé du document

L'ADN de nos cellules est le support de l'information génétique. Cet ADN est continuellement soumis à des agressions qui peuvent provoquer des dommages irréversibles pour la cellule et peuvent entrainer l'apparition de cancers. Afin de limiter ces dommages, il existe des mécanismes de réparation dont le Nucleotid Excision Repair (NER) et la Recombinaison Homologue (HR).
Le NER est un système qui prend en charge des dommages induisant des modifications structurales de l'ADN comme, par exemple, la formation de dimères de thymine après une exposition aux UV. La réparation des dimères de thymine fait intervenir diverses enzymes, principalement l'ADN polymérase.
La HR répare les dommages qui affectent la structure chimique des bases de l'ADN. Cette recombinaison homologue intervient quand il y a des cassures double brin. Elle permet la transmission fidèle du chromosome aux cellules filles. Ce système permet aussi de créer de la diversité génétique en brassant les gènes provenant des chromosomes parentaux par crossing-over.
Au cours de ce TP, nous mettrons en évidence l'implication des produits des gènes RAD1, RAD2, RAD51 et RAD52 (ici notés A, B, C et D) de la levure Saccharomyces cerevisiae dans les deux mécanismes de réparation décrits précédemment.
Nous utiliserons une souche sauvage (Y10000), et des souches mutantes où les gènes énoncés précédemment ont été invalidés et confrontées à la présence de dimère de thymine (irradiation aux UV), ou à des cassures double brin générées in vitro par des enzymes de restriction.
La souche mutante étudiée par notre groupe est la souche nommée A.
Deux souches sont mutantes pour RAD1 et RAD2 impliqués dans les processus de NER, et les deux autres sont mutantes pour RAD51 et RAD52 impliqués dans les processus de HR.
Ces différents mutants seront aussi testés pour leur sensibilité à une molécule anticancéreuse : la bléomycine, qui est un agent mutagène. Ceci nous permettra de conclure sur le type de dommage que provoque cette molécule au niveau de l'ADN.
Remarque : toutes les manipulations se font en conditions stériles pour éviter des contaminations extérieures.

Extraits

[...] L'acétate de lithium perméabilise les cellules en déstabilisant l'organisation de leur bicouche lipidique. Le sorbitol, quant à lui, évite que les cellules n'éclatent en agissant sur le gradient osmotique. Ensuite, après incubation pendant une heure à une brève centrifugation et élimination du surnageant, le culot est suspendu dans un mélange d'ADN plasmidique issu des minipréparations. Une solution est ajoutée, composée de Tris-HCl, EDTA, acétate de lithium et PEG, ce dernier ayant pour rôle de faciliter la pénétration de l'ADN à l'intérieur des cellules. [...]

[...] Ainsi, cette souche serait incapable de réparer le dommage dû à une exposition à la bléomycine. De même que pour le test aux UV, il est possible d'évaluer le pourcentage de colonies en fonction de la concentration en Bléomycine, en prenant pour repère 100% pour une concentration de Bléomycine de 0µg/ml. Les résultats en rose sont ceux de notre groupe Tableau représentant le pourcentage du nombre de colonies des différentes souches En fonction de la concentration en Bléomycine Le graphique et le tableau montrent que plus la concentration en bléomycine augmente, et plus le nombre de colonies diminue, ceci pour toutes les souches. [...]

[...] Ces différents mutants seront aussi testés pour leur sensibilité à une molécule anticancéreuse : la bléomycine, qui est un agent mutagène. Ceci nous permettra de conclure sur le type de dommage que provoque cette molécule au niveau de l'ADN. Remarque : toutes les manipulations se font en conditions stériles pour éviter des contaminations extérieures. Test de sensibilité aux UV Le but de cette expérience est de déterminer les souches capables de réparer les dimères de thymine engendrés par les UV. [...]

[...] Or les souches C et D sont incapables de réparer les cassures double brin donc la Bléomycine provoquerait ce type de dommage. Les résultats pour la souche Y devraient être du même ordre de grandeur que ceux pour les souches A et B. Or il semblerait, d'après nos résultats, qu'Y soit incapable de réparer les cassures double brin. D'après l'hypothèse effectuée précédemment, le gène qui aurait été muté dans la souche Y serait impliqué dans la réparation des cassures double brin. [...]

[...] Les souches A n'ont pas poussé, mais le problème vient probablement de la transformation, car le témoin Y n'a pas poussé non plus. Les mutants C et D ne poussent pas sur milieu sans Leucine. Le témoin Y montre que la transformation a marché, ce qui exclut l'hypothèse d'un problème de transformation. Ainsi, il semblerait que ces souches ne poussent pas, car elles seraient incapables de réparer les cassures double brin, ce seraient donc les mutants pour RAD51 et RAD52, ce qui confirme les résultats obtenus lors du test aux UV. [...]