Enzymologie : étude de la galactosidase

Thèmes abordés

Sciences - Ingénierie - Industrie, Enzymologie, étude de la galactosidase, étalonnage, suivi cinétique, étude d'une enzyme, enzyme tétramérique, intolérance au lactose, substrat, maltose, courbe de concentration

Résumé du document

L'enzyme étudiée ici est la galactosidase, elle catalyse l'hydrolyse du lactose en glucose et galactose. Il s'agit d'une enzyme tétramérique constituée de quatre sous unités identiques, inactives séparément. L'intolérance au lactose est due à l'absence ou la diminution de la production par l'organisme de cette enzyme. Les liaisons Mg2+ stabilisent les associations entre les sous-unités. La spécificité du substrat peut être assez large, ainsi elle hydrolyse aussi galactosides comme le 2-nitrophényl D galactopyranoside (ONPG).

Extraits

[...] 1/Vm = 26545 mol/min donc Vm = mol/min -1/Km = -11134 mol/L-1 donc Km = mol/L-1 Par la suite on met en commun nos résultats avec ceux des autres groupes ayant des concentrations en maltose différentes (0,2M – 0,4M – 0,6M – 0,8M) pour comparer les différents paramètres cinétiques et produire le graphique final représentant 1/V en fonction de 1/S. IV)Conclusion C'est un inhibiteur non compétitif, car Vm diminue suivant la concentration en inhibiteur maltose C'est à dire que le maltose va se lier à l'enzyme ou au complexe enzyme + substrat et il n'a pas d'influence sur la fixation du substrat. [...]

[...] La spécificité du substrat peut être assez large, ainsi elle hydrolyse aussi β-galactosides comme le 2-nitrophényl β-D galactopyranoside (ONPG) Le 2-nitrophénol (ONP) formé dans le cas de l'hydrolyse de l'ONPG présente un maximum d'absorption vers 420nm La réaction : ONPG + H2O = β-D galactopyranose + ONP La β-galactosidase à disposition dans ce TP provient d'Escherichia coli II)Objectif et méthode de suivi de l'activité Séance 1 : L'objectif de cette séance est de suivre la vitesse de formation de l'ONP en fonction du temps et de déterminer les paramètres de Michaelis- Menten (Km et Vm) Pour cela on mesure l'absorbance toutes les 5 minutes d'une solution de Na2CO3,, tampon phosphate pH7 et ONPG Séance 2 : L'objectif de cette séance est de déterminer le type d'inhibition par un composé maltose en concentration 0,8 M et de déterminer les paramètres de Michaelis-Menten Vm et Ki) Pour cela on mesure l'absorbance toutes les 5 minutes d'une solution de Na2CO de β-galactosidase et d'ONPG et maltose III)Discussion 1)Gamme étalonnage pour l'ONP Pour réaliser la gamme étalon nous avons besoin de calculer le facteur de dilution : On convertit les unités en mol/L pour la concentration et en L pour les volumes Ci * Vi = Cf * Vf ↔ Cf = (Ci * Vi) / Vf Tube 2 : ( 1.10 = Mol/L La concentration finale du tube 2 est de Mol/L Tube 3 = 5.10 -5mol/L Tube 4 = 1.10 -4mol/L Tube 5 = - 4mol/L Tube 6 = 2.10 -4mol/L Tube 7 = -4mol/L Tube 8 = 3.10 -4mol/L (sans maltose) = 4382,2 L.mol-1.cm-1 la moyenne de tous les binôme est de 4582,25L.mol-1.cm-1 (avec maltose) = 4810,7 L.mol-1.cm-1 la moyenne de tous les binôme est de 4696,45L.mol-1.cm-1 2)Suivi cinétique Pour nos expériences notre inhibiteur était du maltose en concentration 0,8M Loi de Bee-Lambert : A = * l * C C = A / * l Avec = 4696,45 L.mol-1.cm-1 et l = 1cm Exemple : Tube 2 avec maltose : C = 0,254/ 4696,75 = -5mol.L-1 La suite des résultats sont reportés dans le tableau ci dessous grâce auquel on fait notre graphique du suivi cinétique de ONP. A l'aide du coefficient directeur trouvé grâce à la tangente de la courbe on obtient Vi (vitesse initiale). Vi (sans maltose) = mol/min Vi (avec maltose) = mol/min Le Vi avec maltose est plus petit que le Vi sans maltose, cela explique que le maltose est inhibiteur. [...]

[...] TP enzymologie : Étude de la β-galactosidase I)Introduction L'enzyme étudiée ici est la β-galactosidase, elle catalyse l'hydrolyse du lactose en glucose et galactose. Il s'agit d'une enzyme tétramérique constituée de 4 sous unités identiques, inactives séparément L'intolérance au lactose est due à l'absence ou la diminution de la production par l'organisme de cette enzyme. Les liaisons Mg2+ stabilisent les associations entre les sous-unités. [...]

[...] 3)Déterminations des paramètres cinétiques Km, V'm et Ki) Pour passer de l'absorbance à la vitesse on fait : = V On peut donc obtenir la courbe de la concentration en ONPG en fonction de la vitesse. Pour obtenir Vm et Km on reprend les résultats précédant en faisant 1/V pour les ordonnées et 1/[ONPG] pour les abscisses. Le croisement entre la droite et l'axe des ordonnées est 1/Vm Le croisement ente la droite et l'axe des ordonnées est -1/Km 1/V'm = 34355 mol/min donc V'm = -5mol/min = -17568mol/L-1 donc K'm = -5mol/L-1 A partir de la droite de 1/V en fonction de 1/S sans inhibiteur on obtient 1/Vm à l'endroit où elle croise la courbe des ordonnées et -1/Km à l'endroit où elle croise la courbe des abscisses. [...]