Détermination de la structure d’une protéine

Résumé du document

L'hydrolyse acide est une méthode de choix pour la détermination des acides aminés d'une protéine ou d'un polypeptide. Il n'y a pas de racémisation des acides aminés à l'inverse de l'hydrolyse alcaline. La dégradation de la sérine, de l'arginine et de la cystéine est peu importante. L'échantillon de protéines est introduit dans des tubes de verre scellés sous vide. L'hydrolyse se fait par l'acide chlorhydrique HCl 6N à 110°C pendant 24, 48 ou 72 heures.

Le tryptophane est détruit au cours de l'hydrolyse acide. L'hydrolysat obtenu est un mélange complexe d'acides aminés. Les acides aminés sont séparés par chromatographie échangeuse d'ions et par chromatographie liquide à haute performance. Les acides aminés peuvent être aussi dosés par réaction avec la ninhydrine. Pour la chromatographie, il y a conversion en dérivés de la phénylthiohydantoïne.

Extraits

[...] Le séquençage donne des renseignements sur la position de ces ponts ils n'ont pas été rompus préalablement à la fragmentation des chaînes polypeptidiques. Les banques de séquence Les banques de séquences rassemblent plusieurs milliers de séquences de protéines. Les séquences sont déduites directement de la séquence nucléotidique des gènes. Il est beaucoup plus rapide, efficace et instructif de séquencer un gène cloné que de déterminer la séquence des acides aminés d'une protéine. PIR (Protein Identification Resource), Genbank (Genetic Sequence Data Bank) et EMBL (European Molecular Biology Data Library). [...]

[...] Les acides aminés peuvent être aussi dosés par réaction avec la ninhydrine. Pour la chromatographie, il y a conversion en dérivés de la phénylthiohydantoïne. Stratégie du séquençage d'une protéine 3.1 ) 1e étape : séparation des chaînes polypeptidiques Si une protéine est composée de plusieurs sous-unités, on doit la dissocier en protomère. Pour cela on fait une exposition à des pH extrêmes, à de l'urée 8M, à du chlorure de guanidine, à des concentrations salines élevées ) 2e étape : clivage des ponts disulfure Il existe plusieurs méthodes pour cliver les ponts disulfures : on peut utiliser de l'acide performique, du 2-mercaptoéthanol, de l'acide iodoacétique ou du 3-bromopropylamine. [...]

[...] Les méthodes de clivage enzymatique sont les plus utilisées. La fragmentation se fait par des moyens chimiques spécifiques ou non spécifiques : - la trypsine clive les chaînes polypeptidiques du côté de l'extrémité carboxylique de l'arginine et de la lysine - la chymotrypsine hydrolyse préférentiellement les liaisons peptidiques formées par les groupes carboxyles des acides aminés aromatiques : la phénylalanine, la tyrosine et le tryptophane - les endopeptidases sont moins spécifiques, elles clivent les liaisons peptidiques à l'intérieur d'une chaîne polypeptidique par exemple la pepsine, la papaïne, la subtilisine, la thermolysine et l'élastine - le bromure de cyanogène (CNBr) est une méthode chimique de protéolyse très spécifique et la plus répandue, elle permet la rupture de la liaison peptidique de la méthionine - l'hydroxylamine (NH2OH) à pH 9 clive les liaisons asparagine glycocolle alors qu'en milieu légèrement acide et à 40°C elle clive les liaisons entre les résidus d'acide aspartique et de proline 3.6 ) 7e étape : reconstruction de la séquence totale des acides aminés Les séquences obtenues doivent provenir d'au moins deux modes différents de clivage, il faut identifier tous les recouvrements des séquences partielles pour établir la continuité de la séquence totale de la chaîne polypeptidique. [...]

[...] Le dérivé formé est libéré de l'extrémité de la chaîne du polypeptide, on obtient une phénylhydantoïne (PTH). Puis on identifie par chromatographie les dérivés PTH, le reste de la chaîne polypeptidique est intacte et il est soumis à un nouveau cycle de dégradation d'Edman ainsi on identifie le résidu d'acide aminé suivant. La réaction d'Edman permet d'identifier une extrémité terminale et d'obtenir des informations sur le début de la séquence des acides aminés. On utilise des appareils automatiques qui sont des séquenceurs qui permettent de déterminer la séquence des 50 premiers résidus d'acides aminés à partir de 50 picomoles .2) Analyse de l'extrémité C-terminale L'extrémité C-terminale est déterminée par approche enzymatique grâce à des carboxypeptidases. [...]

[...] Détermination de la structure d'une protéine Sommaire : Hydrolyse acide des protéines Analyse des acides aminés après hydrolyse acide Stratégie du séquençage d'une protéine 3.1 ) 1e étape : séparation des chaînes polypeptidiques 3.2 ) 2e étape : clivage des ponts disulfure 3.3 ) 3e étape : analyse de la composition en acides aminés 3.4 ) 4e étape : identification des résidus N-terminaux et C-terminaux 3.4 .1) Analyse de l'extrémité N-terminale 3.4 .2) Analyse de l'extrémité C-terminale 3.5 ) 5e et 6e étape : fragmentation de la chaîne polypeptidique 3.6 ) 7e étape : reconstruction de la séquence totale des acides aminés 3.7 ) 8e étape : localisation des ponts disulfure Les banques de séquence Hydrolyse acide des protéines L'hydrolyse acide est une méthode de choix pour la détermination des acides aminés d'une protéine ou d'un polypeptide. Il n'y a pas de racémisation des acides aminés à l'inverse de l'hydrolyse alcaline. La dégradation de la sérine, de l'arginine et de la cystéine est peu importante. L'échantillon de protéines est introduit dans des tubes de verre scellés sous vide. L'hydrolyse se fait par l'acide chlorhydrique HCl 6N à 110°C pendant ou 72 heures. Le tryptophane est détruit au cours de l'hydrolyse acide. [...]