Culture en bioréacteur d'Escherichia coli pour la production de GFP recombinante en mode cuvé alimenté

Thèmes abordés

Escherichia coli, production de GFP, bioréacteur, cuvé alimenté, induction thermique, GFP Green Fluorescent Protein, transcription génétique, augmentation de température, laboratoire, niveau d'induction, protéine recombinante, génétique, croissance, métabolisme, physiologie, inoculum, culture, GFP recombinante, culture Fed-batch, taux de croissance, concentration de glucose, glucose, concentration en oxygène, taux de production, taux de chauffage, cycle d'induction

Résumé du document

Les systèmes d'expression par induction thermique dévoilent des niveaux élevés de production de protéines recombinantes et présentent un achèvement biotechnologique important pour la maitrise de l'expression génétique.
En effet, la transcription génétique hétérologue est fortement réprimée à des températures inférieures à 37°C, tandis que les augmentations de température entraînent des niveaux d'induction grandissants jusqu'à atteindre un maximum à 42°C (Wyre, 2014).

Extraits

[...] Culture en bioréacteur d'Escherichia coli pour la production de GFP recombinante en mode cuvé alimenté Rapport de Laboratoire CULTURE EN BIORÉACTEUR D'ESCHERICHIA COLI POUR LA PRODUCTION DE GFP RECOMBINANTE EN MODE CUVÉ ALIMENTÉ PLAN Sommaire Introduction Matériels et méthodes - Matériels - Stratégie de culture - Modèle et simulations à l'appui Résultats et discussion Confrontation de résultats Conclusion INTRODUCTION Les systèmes d'expression par induction thermique dévoilent des niveaux élevés de production de protéines recombinantes et présentent un achèvement biotechnologique important pour la maitrise de l'expression génétique. En effet, la transcription génétique hétérologue est fortement réprimée à des températures inférieures à 37 °C, tandis que les augmentations de température entraînent des niveaux d'induction grandissants jusqu'à atteindre un maximum à 42 °C (Wyre,2014). L'hôte bactérien le plus commun pour la production des protéines recombinantes est E. coli grâce à la connaissance approfondie de sa génétique, sa physiologie, sa croissance et son métabolisme. [...]

[...] [GFP] jusqu'à une valeur de 58 mg/L et un rendement YP/X =31.8348848 Hypothèse : Une sécrétion initiale de GFP à 37 °C peut simuler positivement les cellules à produire de GFP à 30 °C sans induction Influence de la température dans la production du GFP utilisant des inductions À l'induction - La biomasse continue à se multiplier 1er cycle d'induction 42°C - la concentration de substrat diminue accompagnée 1er ajout de glucose - un faible accroissement de GFP Après induction 37°C 1.5 30°C 66 - [Glucose] = constante et le débit d'alimentation é faible et insuffisant 30°C - 1 Multiplication très faible μmax 46 - [GFP] YP/X = 0.0 9h-1 = 522.51 mg GFP g-1 DW 10h 10h30 11h 11h30 12h 12h30 1h 1h30 Temps 2h 2h30 3h 3h30 3h45 YX/S DW g-1glu) YP/S (mg GFP g0 1glu) Influence de la température dans la production du GFP utilisant des inductions 1 cycle d'induction Post-induction 2e cycle d'induction er 2.5 42°C 42°C , [Glucose] , [GFP] Induction 2 - constant, [Glucose] Arrêt d'ajout - [GFP] Pré-Induction 66 37°C 1 37°C 46 30°C 30°C - 30°C - 10h 10h30 11h 11h30 12h GFP (mg 12h30 1h 1h30 Temps 2h Biomasse mgDW/mL 2h30 3h Glucose g/l 3h30 3h μmax YX/S DW g-1glu) YP/S (mg GFP g-1glu) YP/X (mg GFP g-1 DW) Influence de la température dans la production du GFP utilisant des inductions 1er cycle d'induction 2e cycle d'induction 42°C 42°C 37°C 1 37°C 46 30°C 30°C 30°C 10h 10h30 11h 11h30 12h GFP (mg 12h30 1h 1h30 Temps 2h Biomasse mgDW/mL 2h30 3h Glucose g/l 3h30 3h Le profil de débit d'alimentation estimé à partir de simulations de modèles a maintenu à la fois un taux de croissance exponentiel constant et une concentration de glucose fixée à ~ 2 g l-1. À 4,5 cependant, les concentrations de glucose mesurées ont montré une légère tendance à la diminution, de sorte que la fréquence d'alimentation a été augmentée à un niveau supérieur à celui estimé. le glucose n'est pas limitant, [Glu] résiduel =0.78 g l-1 qui permet de produire encore du GFP 5.3. [...]

[...] Influence de pO2 (test de respiromètrie) La concentration limitée d'oxygène disponible dans les instances test de respirométrie 2 testées semble avoir été suffisante pour permettre la production de la GFP PO AM AM AM AM AM AM AM AM AM AM AM PM PM PM PM PM PM PM PM PM PM PM PM PM PM PM PM PM PM PM PM PM 02 :30 :00 :11 :12 :13 :14 :15 :16 :17 :30 2:00 2:15 2:31 2:45 1:00 1:15 1:16 1:17 1:18 1:19 1:37 1:45 2:00 2:30 2:49 2:50 2:51 2:52 2:53 3:16 4:00 : temps Temps dC/dt = -OUR kLa1 0.0030301 C O2 = − 0.0186604566345387 x + = − 0.0152237783154747 x + 5.55089573334704 R² = R² = = − 0.0120466458604154 x + R² = C O2 C O2 OUR OUR OUR 0 Temps à l'équilibre kLa = OUR/(CO2*-CO2eq) kLa2 0.0024025 Temps kLa3 0.0036566 La concentration limitée d'oxygène disponible dans les instances testées semble avoir été suffisante pour permettre la production de la GFP. Résultats Courbe d'ajustement du pH par ajout d'acide ou de base Masse Temps Acide Base pH Confrontation entre simulation et résultats Résultats et discussion Pour ce système d'expression, l'induction de la protéine GFP est obtenue en augmentant la température de culture, de 30 °C à 42 °C. La transcription par l'ARN polymérase hôte s'ensuit lors de l'inactivation du répresseur mutant en augmentant la température au-dessus de 37 °C (Valdez-Cruz et al. 2010). [...]

[...] CONCLUSION À l'échelle laboratoire, l'augmentation des températures de 30 °C à 42 °C peut être facilement accomplie et permet d'exprimer des protéines hétérologues dans des systèmes thermo-inductibles. Cependant, pour les cultures à grande échelle, ces augmentations de température à courte durée sont difficiles à mettre au point en raison des limitations de transfert de chaleur parce que le taux de chauffage diminue à mesure que l'échelle augmente. D'après Caspeta et al la vitesse de chauffage a des effets importants sur le métabolisme, la réponse transcriptionnelle, le stress physiologique et la production de protéines hétérologues dans un E. coli. [...]

[...] OBJECTIFS L'objectif de ces travaux pratiques est : - De mettre au point une stratégie de culture en mode fed-batch - De maximiser le rendement volumétrique de la GFP produite par E. coli pND-GFP. Matériels et méthodes Matériels et méthodes Préparation de l'inoculum ◦ Clone choisi Absorbance (600nm) Fluorescence Biomasse (mgDW/mL) GFP (mgGFP/gDW) 5x 10x 5x 10x Clone Clone Clone Contrôle  Inoculum : 24 h à 30 °C sous agitation  concentration initiale = 0.28 gDW / L Volume inoculation = 200 ml  Milieu de culture : MAX Efficiency DH5alph + antibiotique (200 L) + glucose  Solution d'alimentation : milieu de culture + glucose (20 Description du dispositif expérimental Échantillonnage de 5 ml chaque 30 min pour le suivi de la croissance et de la concentration en glucose Suivie de la concentration de GFP par la sonde de fluorescence(ex nm, em nm) Suivie de - Température - pH - Agitation - PO2 Stratégie de culture Modèle et simulations à l'appui Stratégie de Culture 42°C 42°C 37°C 37°C 30°C 30°C Paramètres de simulation Température Ks(g glu ms glu g DW-1h-1) μmax YX/S DW g-1glu) YP/S (mg GFP g-1glu) YP/X (mg GFPg-1 DW) N/A N/A β (mg GFPgDW-1h-1) Simulation des profils de croissance cellulaire, consommation de glucose et production de GFP en fonction du temps . [...]