Le criblage des colonies recombinantes et la validation des clones positifs

Résumé du document

Pour ce TP, nous avons utilisé le criblage des colonies par PCR mais d'autres techniques existent comme celle faisant appel à des sondes radiomarquées. En effet, nous connaissons la séquence que l'on a clonée, on peut donc fabriquer des sondes à ADN radiomarquées afin d'effectuer un criblage par hybridation de l'ADN des clones transformés avec une sonde spécifique. L'hybridation peut se faire in situ : on effectue des repiquages de clones bactériens cultivés dans des boîtes de Pétri sur des disques de nitrocellulose et, après un temps de culture suffisant, les bactéries de ces répliquages sont ensuite fixées par du NaCl et lysées par la soude qui, en même temps, dénature l'ADN. On effectue ensuite une fixation covalente (6h à 80°C ou 12 min de fixation sous UV) des molécules simples brins correspondantes qui se trouvent immobilisées à l'emplacement de chaque clone. Après hybridation, avec la sonde radioactive, l'autoradiographie révélera les clones positifs.

Extraits

[...] La 2ème méthode est un criblage par digestion enzymatique. Nous avons obtenu des résultats qui n'ont rien donné, nous pouvons donc conclure qu'aucun de nos échantillons n'a réussi à incorporer la séquence d'intérêt dans le plasmide, ils ne pourront donc pas l'exprimer. SOURCES Bibliographie : Biologie moléculaire UE1, 1re année santé par Simon Beaumont aux éditions EdiScience Cours de 2ème et de 3ème année (2010/2012) de M. ELM' SELMI TD de 2ème et de 3ème année (2010/2012) de M. [...]

[...] Après la transcription, il y a formation de deux protéines α et ω qui sont inactivent séparément, mais qui en s'associant forme une enzyme active : la Galactosidase. Pour révéler si on a bien l'association de ces deux protéines, on utilise un substrat chromogène incolore (X-Gal) qui après dégradation par la Galactosidase donne un produit avec une coloration bleue. Cette hydrolyse est à l'origine de la coloration des colonies en bleues. Ce test de coloration permet donc de simplifier l'identification des bactéries ayant intégré ou non les plasmides recombinants. [...]

[...] MATÉRIEL Au cours de ce TP, nous avons utilisé divers matériaux et solutions afin de cribler les colonies recombinantes et de valider les clones positifs. Voici la liste des matériaux utilisés : Boîte de pétrie : Elles contiennent les colonies bactériennes blanches et bleues qui se sont développées. Tubes Eppendorf : Il permet de contenir de petit volume d'échantillon. Il peut être placé directement dans le bain-marie et la centrifugeuse. Cônes : Les cônes jaunes sont à utiliser pour les P20 et P200, et les bleus pour les P1000. [...]

[...] Minifuge , Il permet de faire tomber, au fond du tube, les gouttelettes de l'échantillon, situé sur les parois. Électrophorèse : Elle permet de séparer les acides nucléiques, en fonction de leurs poids moléculaires, sur un gel d'agarose, sous l'action d'un champ électrique. Les acides nucléiques sont globalement chargés négativement, ce qui est dû à la présence des groupements phosphates. Les AN vont donc migrer du pôle Cathode) vers le pôle + Anode). Pour détecter les AN sur le gel, on incorpore du BET Bromure d'Ethidium). [...]

[...] RECHERCHE BIBLIOGRAPHIQUE Ce TP avait pour but le criblage de nos bactéries recombinantes et la validation de l'insertion du plasmide dans nos bactéries. Pour ce TP, nous avons utilisé le criblage des colonies par PCR, mais d'autres techniques existent comme celle faisant appel à des sondes radiomarquées. En effet, nous connaissons la séquence que l'on a clonée, on peut donc fabriquer des sondes à ADN radiomarquées afin d'effectuer un criblage par hybridation de l'ADN des clones transformés avec une sonde spécifique. [...]