DST corrigé Méthode expérimentale en biologie

Résumé du document

Examen TP de Méthodologie, exercices sur la chromatographie et l'électrophorèse

Extraits

[...] On accepte une fluctuation de la MM du au choix du tracé de la droite d'étalonnage Graphe : 1 pt - Tableau : 1 pt) 7. En comparant les valeurs des masses moléculaires déterminées par chromatographie d'exclusion par la taille et par électrophorèse en conditions dénaturantes, donnez le degré d'oligomérisation de l'α-amylase point • Au vue des résultats de chromatographie d'exclusion par la taille (32 kDa) et d'électrophorèse en conditions dénaturantes (27,5 kDa), on peut donc dire que l'α-amylase est monomérique. [...]

[...] Au préalable de la purification, une calibration de cette colonne Superdex 200 (Figure a été réalisée sur un mélange comprenant : Thyroglobuline (669 kDa), Aldolase (158 kDa), Conalbumine (75 kDa), Albumin (45 kDa), Chymotrypsinogène (25 kDa), Dichromate de potassium (294 Da). Le débit imposé au cours de cette chromatographie est de 0,5 mL/min et le tampon d'élution est du 0,2 M NaCl mM acétate de sodium pH et le volume des fractions collectées est de 1 mL. Une mesure d'activité enzymatique est réalisée sur toutes les fractions issues de la chromatographie d'exclusion par la taille. Le chromatogramme et l'activité enzymatique correspondant à l'α-amylase sont présentés dans la figure B. [...]

[...] Donnez le rôle de ces 2 molécules points • Le SDS est un détergent anionique ayant 2 rôles en électrophorèse en conditions dénaturantes. Premièrement, il permet la solubilisation des protéines (1pts) et il amène une charge négative. Si la protéine est correctement dénaturée par la chaleur et si aucun pont disulfure n'existe on estime que 1,4 g de SDS se fixera par g de protéine. Ce qui correspond statistiquement à une molécule de SDS pour 2 acides aminés. • Le β-mercaptoéthanol est quant à lui un agent réducteur permettant la réduction des ponts disulfures.(1pts) 6. [...]

[...] Quels paramètres sont mesurés par la thyroglobuline et le dichromate de potassium dans le mélange de calibration de la colonne Superdex 200 ? Donnez-en une définition points • La thyroglobuline du fait de sa haute masse moléculaire permet de déterminer le volume mort Volume d'exclusion ou Vi (volume interstitiel)] (1pts) et le dichromate de potassium lui permet de déterminer le volume total de la colonne du fait de sa masse moléculaire très faible (1pts). • Le volume mort d'une colonne est déterminé par une molécule dont la masse moléculaire est largement supérieure au domaine de fractionnement et qui sera donc exclue des billes de la résine. [...]

[...] Connaissant le V0 et Vt, on peut donc calculé le Kav pour l'α amylase suivant la formule : Ve−V 0 85,5−40 Kavα amylase = = =0,65 (1pts pour la formule et 1pts pour le résultat) Vt −V 0 110−40 Et à partir de la figure A ; on trouve log = 4,5 soit une masse moléculaire pour l'α amylase de 104,5 = 31623 Da (32 kDa) (1pts) 1/4 Partie Électrophorèse : 10 points 4. Le chercheur a vérifié la pureté des fractions 84 à 87 par électrophorèse en conditions dénaturantes. [...]