Compte rendu d'un travail pratique d'initiation à la biologie moléculaire

Résumé du document

Le but de notre TP est d'extraire l'ADN plasmidique à partir d'une culture de bactéries Escherichia coli, en utilisant la technique de la lyse alcaline. Cette méthode permet de récupérer une grande quantité d'ADN plasmidique plus ou moins pur, c'est-à-dire peu contaminé par d'autres ADN, des protéines... On soumettra les ADN obtenus par les différents groupes, additionnés ou non à une RNase I, à une électrophorèse sur gel d'agarose. L'ensemble de ces manipulations nous permettra de déterminer la quantité théorique et expérimentale de plasmide extraite de la culture bactérienne, nous permettant d'établir le rendement de l'extraction.

Extraits

[...] = 6 µg A partir de ces deux valeurs, nous pouvons déterminer le rendement de l'extraction, en effectuant le rapport de la quantité expérimentale sur la quantité théorique. Rendement = (Qté exp. / Qté théo.) x 100 Rendement = / 1,74) x 100 Rendement = Ce rendement ne semble pas logique, mais cela provient du fait que, nous ne mesurons pas l'absorbance que de l'ADN plasmidique, mais également celle des ARN. Ce résultat anormal n'est pas obtenu par les groupes ayant ajouté des RNases qui dégradent les ARN. [...]

[...] Compte rendu d'un travail pratique d'initiation à la biologie moléculaire But Le but de notre TP est d'extraire l'ADN plasmidique à partir d'une culture de bactéries Escherichia coli, en utilisant la technique de la lyse alcaline. Cette méthode permet de récupérer une grande quantité d'ADN plasmidique plus ou moins pur, c'est-à-dire peu contaminé par d'autres ADN, des protéines . On soumettra les ADN obtenus par les différents groupes, additionnés ou non à une RNase à une électrophorèse sur gel d'agarose. [...]

[...] Certains y ajouteront de la RNase, d'autres non. Nous ajoutons alors 200 µL de solution 2. Nous agitons très doucement par retournement, puis nous incubons 3 minutes à température ambiante. Nous ajoutons 150 µL de la solution puis nous agitons de la même manière, pour incuber par la suite 5 minutes dans la glace. Nous centrifugeons à 10000 tr/min, à pendant 10 minutes. Nous récupérons le surnageant dans un nouveau tube, afin de lui ajouter deux volumes d'éthanol absolu. Nous mélangeons et incubons 15 minutes à 4°C. [...]

[...] Nous en mesurons l'absorbance dans une cuvette en quartz de 1mL. Nous obtenons alors une DO à 260 nm (longueur d'onde à laquelle les acides nucléiques absorbent), qui est égale à 0,1 nm. Sachant qu'une unité de DO correspond à 50 µg/mL d'ADN double brin, nous pouvons en déduire la masse expérimentale d'ADN plasmidique extraite. Qté exp. = DO260 x Masse d'ADN double brin x Facteur de dilution Qté exp. = 0,1 x 50 x 80 Qté exp. = 400 µg/mL Sachant que nous sommes partis de 15 µL d'ADN plasmidique, alors : 400 µg x 1 mL = 1.103 µL = : ? [...]

[...] Nous disposons de chaque côté un marqueur de taille, puis nous faisons migrer à 50V pendant une heure. Nous observerons plusieurs tâches à différents niveaux lors de la révélation au BET par fluorescence aux UV. II) Résultats (TP réalisé théoriquement, pour cause de problèmes de cultures insuffisantes) Lors de la mesure de la densité de cellules de l'aliquote de la culture à 600nm, nous obtenons une Densité Optique de 0,8. Sachant qu'une unité de DO à 600nm correspond à 7.108 bactéries par millilitre, nous pouvons en déduire la masse théorique d'ADN plasmidique. [...]