Compartimentation fonctionnelle et régulation de l’expression des gênes: régulation par le fer de l’expression de l’ARNm du récepteur de la transferrine dans la lignée cellulaire humaine 293

Résumé du document

La protéine RTf est un récepteur à la transferrine dont l'expression régule la captation par les cellules du fer lié à la transferrine circulante. La transferrine est la principale protéine de transport du fer qui s'effectue de l'intestin vers les réserves hépatiques et vers les réticulocytes. Cette protéine est synthétisée par le foie. Les récepteurs à la transferrine sont présents sur presque toutes les cellules, mais plus particulièrement sur les hépatocytes, érythrocytes immatures et cellules en division rapide malignes ou non malignes. Une modulation du nombre de récepteurs à la transferrine exprimés à la surface de ces cellules peut réguler leur absorption en fer. Pour cela, des éléments de réponse au fer (IRE) régulent la transcription des récepteurs à la transferrine par l'ARNm. Une fois capté par la cellule, le fer est stocké grâce à la ferritine.
La ferritine est une protéine permettant le stockage intracellulaire du fer. Elle joue un rôle clé dans son métabolisme, permettant de réguler l'absorption intestinale du fer en fonction des besoins de l'organisme. Elle a ainsi une fonction de réserve et de détoxification du fer. Son action peut être associée à celle d'un chélateur. La libération quantitative du fer par la ferritine dépend également de carences ou excès de fer dans l'organisme. Cette protéine est localisée dans les macrophages réticuloendothéliaux et les hépatocytes.

Extraits

[...] Une modulation du nombre de récepteurs à la transferrine exprimés à la surface de ces cellules peut réguler leur absorption en fer. Pour cela, des éléments de réponse au fer (IRE) régulent la transcription des récepteurs à la transferrine par l'ARNm. Une fois capté par la cellule, le fer est stocké grâce à la ferritine. La ferritine est une protéine permettant le stockage intracellulaire du fer. Elle joue un rôle clé dans son métabolisme, permettant de réguler l'absorption intestinale du fer en fonction des besoins de l'organisme. [...]

[...] En effet la RT-PCR montre que l'ARNm du récepteur à la transferrine est plus exprimé quand la concentration ferrique est faible. Un dosage de la protéine permettrait de déterminer si cet ARNm est bien traduit. La technique du Western Blot peut être utilisée. Tout d'abord, la lignée cellulaire HEK 293 est cultivée dans les mêmes trois conditions différentes que pour la RT-PCR puis les cellules sont lysées et centrifugées afin de purifier les protéines. Avec les trois solutions obtenues, un Western Blot est réalisé : ajout de SDS (détergeant) aux solutions afin de charger négativement les protéines, réalisation d'une électrophorèse sur gel (les protéines contenues dans les solutions migrent selon leurs tailles), transfert de l'électrophorèse sur une membrane puis incubation avec des anticorps spécifiques du RTf couplés à une molécule fluorescente. [...]

[...] Une approximation de leur taille est alors possible grâce à la comparaison des bandes des ARNm et de celles des marqueurs de la gamme étalon. Ainsi l'ARNm de GAPDH a une taille d'environ 200pb et l'ARNm de RTf d'environ 350pb. Un deuxième paramètre est observable sur cette photographie, il s'agit de l'intensité des bandes obtenues. Celle-ci correspond à la quantité d'ADNc présente. Plus l'intensité est élevée, plus la quantité d'ADNc est importante. Les ARNm de GAPDH ont été utilisés comme témoin. [...]

[...] Au cours de ce TP, la régulation par le fer de l'expression de l'ARNm codant pour les récepteurs de la transferrine est mise en évidence dans la lignée cellulaire humaine 293 à l'aide d'une RT PCR. MATÉRIELS ET MÉTHODES Les cellules utilisées proviennent de la lignée cellulaire HEK293. Ces cellules adhérentes sont mises en culture trois jours dans un milieu DMEM additionné de SVF, un facteur de croissance des cellules, de pénicilline évitant toute contamination bactérienne et de streptomycine. Après leur période d'ensemencement, les cellules sont cultivées selon trois conditions de culture : ajout de citrate d'ammonium ferrique correspondant à un taux de fer élevé F ; ajout de déféroxamine correspondant à un taux de fer bas D et ajout d'un milieu composé pour moitié de citrate d'ammonium ferrique et de l'autre de déféroxamine permettant la réalisation du contrôle C Après 24 heures d'incubation, les cellules sont lysées afin d'y extraire leur ARN. [...]

[...] Concernant le RTf la concentration en fer du milieu a une influence sur l'expression de l'ARN. Les résultats pour les ADNc, pour un milieu pauvre en fer D sont bons. En effet, la concentration en fer étant faible, son absorption est plus importante et augmente à chaque cycle de PCR, ceci est indiqué par des bandes de forte intensité. En effet, à chaque nouveau cycle de PCR, de nouvelles amorces se fixent et permettent la formation de plus d'ADNc. Dans le cas où la concentration en fer est importante F les résultats ne montrent rien. [...]