Compartimentation fonctionnelle et régulation de l’expression des gènes: le cytosquelette des cellules cancéreuses de colon humain HT29

Résumé du document

Le cytosquelette des cellules cancéreuses de colon humain HT29
Les cellules situées dans le colon humain sont des cellules épithéliales. A cause de leur juxtaposition, elles sont de forme pavimenteuse (plus large que haute). Elles possèdent des microvillosités qui sont des expansions cytoplasmiques. Les cellules étudiées ici sont cancéreuses, elles ont donc acquis une capacité de prolifération indéfinie. Cela est dû à des mutations qui créent des cassures dans l'ADN affectant les gènes de prolifération cellulaire.
Dans ce TP, le cytosquelette de ces cellules cancéreuses, appelées HT29, sera étudié. Ce cytosquelette assure une certaine rigidité à la cellule et sert à la fixation des organites des cellules eucaryotes. Il se réorganise en permanence et gouverne les mouvements internes, comme le déplacement de chromosomes et les déformations de la membrane. Il est composé de trois types de filaments. Le filament intermédiaire est constitué de polymères de cytokératines et possède une stabilité relative. Les microtubules sont des structures qui ressemblent à des tubes creux et dont les parois sont formées de tubuline. Ils rayonnent autour d'un centre organisateur, le centrosome et ont des extrémités polarisées. Et enfin les microfilaments ou filaments d'actine ont une structure double brin hélicoïdale. L'actine est la protéine intracellulaire la plus abondante. Une autre protéine peut s'interconnecter à l'actine, il s'agit de l'α-actinine.
Le but de cette expérience est de localiser les quatre types de protéine suivantes : β- tubuline, actine, α-actinine et cytokératine. Il s'agit se voir comment elles sont organisées dans les cellules épithéliales cancéreuses. L'objectif est ensuite de voir si cette organisation est la même que celle présente chez une cellule saine.

Extraits

[...] Ils assurent la résistance à la déformation cellulaire et le maintien de la cohésion entre les cellules via les desmosomes. Ce sont des régions où la membrane plasmique d'une cellule adhère à la lame basale sous-jacente ou à une cellule adjacente. C'est pourquoi le marquage était plus important au niveau des jonctions entre les cellules. En effet, les cellules cancéreuses se regroupent en amas contrairement aux cellules normales. Dans les cellules HT29, la fluorescence est plus importante que dans les cellules saines, elles sont donc plus présentes. [...]

[...] Perméabilisation et fixation des cellules Les chambres de culture sont sorties de l'incubateur à 37°C. Le milieu de culture est enlevé à la pipette (en prenant soin de ne pas endommager les cellules) et 2 rinçages avec 200 µl de PBS sont effectués pour chaque compartiment. Le PBS (Phosphate Buffered Salin) préserve l'osmolarité des cellules et évite l'éclatement en se rapprochant des conditions physiologiques de l'organisme. Celui-ci est préparé à partir de NaCl (0,138 KCl Na2HPO4 (10 mM) et KH2PO4 mM). [...]

[...] Observation Les parois des compartiments de la chambre sont enlevées délicatement, ainsi que le joint siliconé, laissant place à une lame observable directement au microscope. Une goutte de solution de montage est déposée sur les cellules. La solution de montage permet d'éviter le dessèchement et de diminuer la vitesse de disparition de la fluorescence sous UV. Une lamelle de verre est déposée sur les cellules. Le montage est conservé à l'abri des UV jusqu'à l'observation. Celle-ci se fera au microscope à épifluorescence. [...]

[...] Le PBS est ensuite retiré et est remplacé par une solution de PBS-Tween 0,05% (volume/volume) contenant (poids/volume) de lait écrémé. Cette solution est composée de 5ml de PBS-Tween 0,05% et de 0,25g de lait. Le Tween 20 est un détergent spécifique qui détruit les liaisons non spécifiques. Le lait écrémé, en particulier la protéine caséine, va permettre la saturation des sites, permettant ainsi aux anticorps de se fixer uniquement sur les protéines recherchées. Les compartiments sont mis à 37°C sous-agitation pendant 30 minutes. [...]

[...] L'actine est la protéine intracellulaire la plus abondante. Une autre protéine peut s'interconnecter à l'actine, il s'agit de l'α-actinine. Le but de cette expérience est de localiser les quatre types de protéine suivants : β- tubuline, actine, α-actinine et cytokératine. Il s'agit se voir comment elles sont organisées dans les cellules épithéliales cancéreuses. L'objectif est ensuite de voir si cette organisation est la même que celle présente chez une cellule saine. La technique utilisée ici est celle de l'immunofluorescence indirecte. Elle utilise deux anticorps. [...]