Clonage et expression d'un gène codant une protéine d'intérêt thérapeutique

Thèmes abordés

Sciences biomédicales, Clonage d'un gène, expression d'un gène, protéine d'intérêt thérapeutique, plasmide recombinant, bactérie, amplification d'un gène, protéine fluorescente GFP, ADN génomique bactérien, amplification d'ADN in vitro, étape de dénaturation, étape d'hybridation, étape d'élongation, électrophorèse sur gel d'agarose, masse moléculaire, ligation du produit d?amplification, plasmide pCR-Blunt II-TOPO, gènes de résistance, antibiotique la Kanamycine, opéron lactose, gène lacZ, toxine ccdB, souche d'Escherichia coli, PCR par électrophorèse, clone positif, biomasse, purification de la protéine d'intérêt, lyse cellulaire, dosage des protéines, broyeur à billes de verre, méthode de Bradfort, chromatographie d'affinité, atome de nickel, atomes d?histidines, rétention des protéines recombinantes, western-blot, qualité de la purification, électrophorèse SDS-PAGE, membrane de nitrocellulose, anticorps primaire, modifications post traductionnelles, EPO érythropoïétine, somatropine recombinante, maladie de Turner

Résumé du document

Le but de cet exercice est de cloner et exprimer le gène codant une protéine d'intérêt thérapeutique. Notre protéine d'intérêt est la protéine fluorescente GFP (de couleur vert). La fluorescence est la capacité d'une molécule à absorber de la lumière d'une certaine couleur et de la réémettre dans une autre couleur. Nous avons réalisé différentes tâches s'étalant sur 5 jours.

Extraits

[...] On travaille à 4°C pour diminuer l'activité des protéases, pour empêcher leur action c'est-à-dire de couper les liaisons peptidiques. Après avoir lyser les bactéries, on centrifuge notre tampon contenant les constituants de des bactéries et on obtient le surnageant qui contient les protéines et le culot contenant les membranes des bactéries, leurs parois, les billes de verres. On récupère le surnageant qui contient TOUTES les protéines de la bactérie + nos protéines d'intérêt que l'on nomme PT . On réalise maintenant un dosage des protéines de l'on a dans notre tube par la méthode de Bradfort. [...]

[...] Le but est de quantifier les protéines que l'on a. On utilise un colorant, le bleu de Coomassie, qui se lie à certains acides aminés. Pour réaliser tout cela, on prend une gamme étalon avec des concentrations connues, ou l'on compare la quantité de BSA et la densité optique. On fera la même chose avec notre échantillon de protéines, que l'on considérera comme équivalentes à la Bovine Sérine Albumine (notre protéine de référence). Purification de la protéine d'intérêt par chromatographie d'affinité́ sur billes Ni-NTA La chromatographie d'affinité se base sur le principe de l'adsorption spécifique. [...]

[...] Cette enzyme transforme le lactose théoriquement. Notre gène d'intérêt est inséré dans ce gène lacZ. Si des colonies bleues apparaitront, alors cela sera la preuve de l'activité de la Beta-galactosidase et on aura des plasmides non recombinants. Si on introduit notre gène inséré dans le gène lacZ, celui-ci ne sera plus fonctionnel et les colonies seront blanches. On peut voir si le plasmide à un insert ou non. Nous avons mis artificiellement dans notre zone de clonage des sites de restriction d'endonucléases, pour être sur notre gène d'intérêt soit inséré au bon endroit. [...]

[...] Clonage et expression d'un gène codant une protéine d'intérêt thérapeutique Le but de cet UE est, par binôme, de cloner et exprimer le gène codant une protéine d'intérêt thérapeutique. Notre protéine d'intérêt est la protéine fluorescente GFP (de couleur verte). La fluorescence est la capacité d'une molécule à absorber de la lumière d'une certaine couleur et de la réémettre dans une autre couleur. Nous avons réalisé différentes tâches s'étalant sur 5 jours, le jour 1 étant pour moi le plus intéressant car ce sont les étapes les plus importantes et les manipulations sont très diverses. [...]

[...] En effet, si on veut exprimer le gène dans la cellule hôte par la suite, il faut que celle-ci puisse assurer les modifications post traductionnelle de la protéine, et les bactéries en sont incapables. De plus la bactérie peut créer des corps d'inclusion (agrégats) rendent les protéines insolubles ou mal repliée. On utilisera alors plus des modèles eucaryotes qui miment les glycosylations humaines plutôt que les bactéries. L'érythropoïétine (EPO) recombinante est la première protéine d'intérêt thérapeutique produite un modèle cellulaire eucaryote qui m'est venu à l'esprit. C'est une hormone sécrétée par les reins et qui dépend de l'apport en oxygène. Elle sert à traiter les patients qui sont anémiés ou en insuffisance rénale. [...]