Cahier de manipulations - la production de la ß-galactosidase, une enzyme appartenant à la famille des hydrolases

Résumé du document

Une protéine peut être produite en réalisant un clonage du gène codant celle-ci sur un vecteur. Le but de ce TP est de produire la β-galactosidase, une enzyme appartenant à la famille des hydrolases. En effet, cette dernière catalyse la réaction d'hydrolyse des β-galactosides en monosaccharides. La β-galactosidase est une protéine tétramérique de 464 kDa. Chaque sous-unité de l'enzyme est composée de cinq domaines dont le troisième forme le site catalytique de l'enzyme. Ce dernier pouvant accueillir différents substrats spécifiques et d'analogie structurale. La β-galactosidase est codée par le gène Lac Z situé sur l'opéron lactose.

Dans un premier temps, un clonage du gène Lac Z sera effectué dans le plasmide p QE60, un plasmide de 3431 pb contenant un site multiple de clonage, un gène de résistance à l'ampicilline, un promoteur de l'opéron Lac Z et une étiquette histidine. Cette dernière servira à la purification de l'enzyme. Le gène Lac Z, quant à lui, sera d'abord extrait du plasmide pSV-gal, ayant un promoteur fort et permettant ainsi une meilleure réplication. Une transformation sera ensuite effectuée sur des bactéries compétentes. Celles qui seront rendues compétentes sont en fait des bactéries Gram - très connues (Escherichia coli).

Dans un deuxième temps, la β-galactosidase sera produite en grande quantité par les bactéries (induction), puis extraite pour ensuite être purifiée afin d'étudier ses propriétés enzymatiques et notamment ses caractéristiques cinétiques.

Extraits

[...] Grâce au précédent gel qui révélait l'activité de la β- galactosidase, la coloration jaune permet de localiser cette dernière. Les deux gels ayant migré dans le même temps, il est alors possible d'expliquer les bandes obtenues. Comme pour le zymogramme, aucune bande n'est visible pour la fraction F10. Les bandes sont révélées par le bleu de Coomassie. Ce dernier fixe les protéines au niveau de leurs groupements amines. Ce gel permet donc de voir l'ensemble des protéines présentes. Il révèle également les agrégats de l'enzyme sous sa forme tétramérique. [...]

[...] Il permet à l'échantillon une entrée homogène dans le gel de séparation. Plus le gel de séparation est dense et meilleure sera la séparation des protéines. Le gel PAGE ou poly acrylamide gel electrophoresis, est généré à partir de molécules d'acrylamides et de bisacrylamide. A l'aide d'un courant électrique, les protéines natives déposées sur ce gel migreront en fonction de leur taille et de leur charge. Un gel est révélé au bleu de Coomassie dans le but de révéler toutes les protéines ainsi que leur taille. [...]

[...] Lorsque Volume d'élution est supérieur à 44 ml, les valeurs d'absorbance restent constantes et proches de 0. La courbe est similaire à l'absorbance à 280 nm en fonction du volume d'élution puisque les protéines sont mesurées à l'absorbance des acides aminés aromatiques et la méthode de Bradford est similaire puisque le bleu de Coomassie se lie aux acides aminés aromatiques et basiques. Calcul du rendement de purification : Activité enzymatique avant purification c'est-à-dire dans le lysat. Activité enzymatique après purification à savoir, dans les fractions éluées au tampon B (F10 mélangé à F11). [...]

[...] Etape 8 : Etude cinétique de la β-galactosidase Les paramètres cinétiques de la β-galactosidase peuvent être déterminés à partir de l'hydrolyse d'un substrat de synthèse, l'ONPG (orthonitrophényl- Bêta-galactoside). En effet, l'hydrolyse de ce dernier en milieu alcalin permet l'obtention de l'ion orthonitrophénate, qui peut être détecté par spectrophotométrie grâce à sa coloration jaune. Etude de la vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat Préparation de solutions de tampon TS pH 7,5 pour un volume final de 0,9 mL avec différentes quantités d'ONPG : Fractions Interprétation Sur les deux courbes (lysat et fractions), on observe une augmentation de l'absorbance en fonction de la quantité d'oNPG ajoutée. [...]

[...] A chaque solution sont ajoutés de l'o NPG et de l'enzyme provenant des fractions. Après 10 minutes d'incubation à la réaction enzymatique est stoppée avec du Na2CO3. Des mesures d'absorbance à 420 nm sont ensuite effectuées. Résultats Interprétation Le graphe montre une température optimale de 50°C pour la β- galactosidase. Cette température est définie par l'équilibre entre la diminution de l'agitation thermique et le processus de dénaturation. En dessous de cette température optimale, il y a une faible agitation thermique et l'enzyme se rigidifie. [...]