Cahier de manipulations de la production d'une protéine par clonage d'un gène sur un vecteur

Résumé du document

Une protéine peut être produite en réalisant un clonage du gène codant celle-ci sur un vecteur. Le but de ce TP est de produire la β-galactosidase, une enzyme appartenant à la famille des hydrolases. En effet, cette dernière catalyse la réaction d'hydrolyse des β-galactosides en monosaccharides. La β-galactosidase est une protéine tétramérique de 464 kDa.

Chaque sous-unité de l'enzyme est composée de cinq domaines dont le troisième forme le site catalytique de l'enzyme. Ce dernier pouvant accueillir différents substrats spécifiques et d'analogie structurale. La β-galactosidase est codée par le gène Lac Z situé sur l'opéron lactose.

Dans un premier temps, un clonage du gène Lac Z sera effectué dans le plasmide p QE60, un plasmide de 3431 pb contenant un site multiple de clonage, un gène de résistance à l'ampicilline, un promoteur de l'opéron Lac Z et une étiquette histidine. Cette dernière servira à la purification de l'enzyme. Le gène Lac Z, quant à lui, sera d'abord extrait du plasmide pSV-gal, ayant un promoteur fort et permettant ainsi une meilleure réplication. Une transformation sera ensuite effectuée sur des bactéries compétentes. Celles qui seront rendues compétentes sont en fait des bactéries Gram - très connues (Escherichia coli).

Dans un deuxième temps, la β-galactosidase sera produite en grande quantité par les bactéries (induction), puis extraite pour ensuite être purifiée afin d'étudier ses propriétés enzymatiques et notamment ses caractéristiques cinétiques.

Extraits

[...] Il possède donc la propriété de fixer durablement des ions positifs pour former un complexe soluble. Il permet donc l'inhibition de beaucoup de protéases qui sont des métalloprotéases, c'est-à-dire des protéines qui ont besoin d'un métal dans leurs sites actifs pour être actives. De plus, le travail dans la glace permet d'inhiber les protéases. La lyse s'effectue en deux étapes : La première étape consiste à fragiliser les parois grâce à une enzyme, le lysozyme, qui hydrolyse les liaisons osidiques du peptidoglycane (qui relie par une liaison osidique la acétylglucosamine et l'acide N-acétylmuramique). [...]

[...] Les ondes de pression des vibrations produisent des microbulles qui vont grandir subitement puis imploser. Ceci s'accompagne d'une haute et brève augmentation locale de la pression et de la température. Les inconvénients majeurs de cette méthode sont les échauffements qui pourraient dénaturer les protéines ainsi que les paramètres à modifier pour à la fois lyser les bactéries et conserver l'intégrité de la β- galactosidase. Il faut donc travailler dans de la glace et alterner des temps de sonication avec des temps de refroidissement. [...]

[...] Il défavorise la formation du complexe de Michaelis- Menten de l'oNPG. Pour déplacer cet inhibiteur du site actif de l'enzyme qu'il occupe, il faudrait augmenter la concentration en oNPG soit une concentration supérieure à 1,88 mg/m L. De ce fait le complexe ES avec l'oNPG sera alors favorisé. En fonction de l'IPTG : Méthode Des solutions d'éthanol à et 100% sont préparées. Le protocole est ensuite le même que pour l'IPTG. Résultats Interprétation L'éthanol est un solvant organique. En ajoutant l'enzyme aux solutions d'éthanol, celle-ci va changer de conformation et notamment au niveau de son site actif. [...]

[...] Comme les molécules ont trop migré, on observe en fait les protéines à haut poids moléculaire (180 KDa). Le bleu de bromophénol n'a pas permis une bonne indication de la migration comme on l'attendait puisque les bandes ont migré plus rapidement que ce dernier. Les sous-unités de l'enzyme d'intérêt ayant des poids moléculaires inférieures à 180 KDa, la possibilité de les voir sur le gel est improbable. L'interprétation est rendue d'autant plus difficile que le marqueur de taille n'est pas visible sur le gel. [...]

[...] Suit ensuite une migration sur gel d'agarose avec un contrôle positif correspondant au plasmide pSV- gal. Interprétation Cependant après révélation, il s'est avéré qu'aucune bande n'était visible aux endroits correspondant aux inserts de chacun des deux clones. Cela signifie qu'il y a eu un problème de ligation. En effet, le plasmide pQE60 (contenant le gène de résistance à l'ampicilline) a bien été intégré dans les bactéries puisqu'elles ont résisté à l'ampicilline. Pour la suite des manipulations, les clones d'un autre binôme ont été utilisés. [...]