TP de biologie HPLC (Chromatographie Liquide Haute Performance)

Résumé du document

Lors de ce TP la phase stationnaire dans la colonne étant apolaire, chaque soluté s'absorbe sur la phase stationnaire par des forces de rétention pour un temps donné (Temps de rétention TR) spécifique au soluté. Plus le soluté est polaire, moins le temps de rétention TR est important (...)

Extraits

[...] Les limites de la HPLC sont les suivantes : On ne peut pas utiliser tous les types de chromatographie à cause de la pression trop importante qui risquerait d'écraser les phases stationnaires de certaines chromatographies Il nous faut des produits qui absorbent tous à une seule longueur d'onde donnée. Si l'un d'entre-eux n'absorbe pas à la longueur d'onde programmée, il ne sera pas détecté. Cette technique ne permet pas de récupérer et purifier les produits comme d'autres chromatofrapies (ils resortent trop dilués). [...]

[...] Le temps de rétention varie avec la pression, plus la pression est faible plus le temps de rétention est important. Par conséquent les produits sont séparés. Cela peut être intéressant pour des produits qui ont une résolution de moins de si on diminue la pression les produits auront une résolution plus grande (de là vient qu'ils seront plus facilement séparés). Partie Lors du rinçage de l'appareil (HPLC) avec du méthanol, on a pu remarquer que la pression est passée de 107 à 62 bar pour un débit de 1 ml/min à la fin du rinçage. [...]

[...] En effet, la phase fixe est apolaire, or le methanol est un produit très polaire, il n'est donc quasiment pas retenu par cette phase stationnaire, et il sort rapidement de la colonne, il est détecté par des interferences, mais pas par le détecteur à 270nm. Le temps que le méthanol sorte corresponde au volume mort de la colonne. Le produit 21 preparé le 12-01-08 présente une oxydation partiellement, qui donne une faible concentration de 22 présent dans la solution. Le temps de rétention réel est le temps mesuré de sortie du produit moins le temps de sortie du méthanol determiné par le détecteur. [...]

[...] K=temps de rétention A/temps de rétention B Entre 18 et 20: K=8,74 / 9,63 La résolution entre les produits: C'est le paramètre qui quantifie la qualité de la séparation entre différents éléments R=2 * (temps de retention 2 - temps de retention (largeur de la basse du pic 2 + largeur de la basse du pic Entre S1 et S2: R=2 * (9,63-8,74)/(3,14+3,41) Pour une bonne résolution R doit être supérieure à 1,5. Cela est refleté sur le chromatogramme par des pics bien separés même à leurs bases. Courbe de la pression en fonction du débit: On peut voir que la pression dépend du débit , et qu'elle est proportionnelle. [...]

[...] Conclusion: La Chromatographie Liquide Haute Performance nous a permis d'analyser qualitativement et quantitativement un mélange inconnu. Ce mélange etait composé des produits et 22, avec des concentrations différentes : Dans le mélange on à 1volume du produit volume du produit 20 et 3 volume du produit 21. On a pu calculer la vitesse d'oxydation du produit 21 en produit 22. Le produit 21 se transforme par oxydation entierement en produit 22, il faut 112 jours ( plus ou moins 4 mois ) Par la suite nous avons déterminé les différents caractères de la colonne : Le nombre de plateaux théoriques L'efficacité La sélectivité La résolution Ces différents paramètres permettent de dire que les produits sont bien separés. [...]