Analyse du cycle cellulaire de la levure Saccharomyces cerevisiae par marquage du cytosquelette d'actine et cytométrie de flux

Résumé du document

Le but du TP est d'étudier les principes des techniques de fluorescence ainsi que l'utilisation d'un microscope à épifluorescence et d'un cytomètre de flux. Mais également étudier le cycle cellulaire de la levure Saccharomyces cerevisiae en réalisant un marquage du cytosquelette d'actine-F de la levure afin de mettre en évidence le rôle de l'actine dans la polarisation de la cellule et le déroulement du cycle cellulaire. On complétera cette étude par l'observation du noyau des cellules et l'analyse des cellules par cytométrie de flux.

Extraits

[...] Le cycle cellulaire comprend deux périodes ; l'interphase constituée elle-même de 3 phases qui sont : G1 : phase de croissance cellulaire et d'activité métaboliques normales S : phase de la réplication de l'ADN G2 : phase préparant la mitose Et la phase M qui comprend la mitose correspondant à la division du noyau et la cytocinèse ou cytodiérèse (division du cytoplasme). Nous allons donc étudier les principes des techniques de fluorescence ainsi que l'utilisation d'un microscope à épifluorescence et d'un cytomètre de flux. [...]

[...] L'iodure de propidium est un agent intercalant des acides nucléiques et une molécule fluorescente ayant une masse moléculaire. Il est couramment utilisé comme marqueur de l'ADN afin de marquer le noyau des cellules ayant perdu leur intégrité membranaire. Résultats * DO600nm DO600nm de la culture de nuit ON DO600nm de la culture prélevée à 1h DO600nm de la culture prélevée à 2h 6,64 nm 0,041 nm 0,075 nm * Densité de la culture cellulaire La densité moyenne de la culture cellulaire de nuit ON est de 8,78.10[10] cellules par litres. [...]

[...] On est principalement dans une phase de division cellulaire pour t=2h alors que l'on est principalement dans une phase de synthèse pour l'ON marqué. * Stratégie de « gating » utilisée La stratégie de « gating » permet, lors de l'analyse des échantillons de cytométrie de flux, de retirer les cellules « impropre » à l'étude. Comme par exemples des cellules qui seraient passé dans le cytomètre de flux au moment de leur division cellulaire. Pour réaliser le « gating » sur le logiciel BD Acury C6 Plus il faut choisir un « plot », puis sélectionner le type de courbe souhaité ainsi que l'échantillon à représenter (exemple t=1h). [...]

[...] Discussion sur les résultats obtenus concernant l'étude du cycle cellulaire de la levure avec les deux approches expérimentales en mettant en avant leur complémentarité Bibliographie Absorption et fluorescence : principes et applications Auteur(s) : Albani, Jihad René Editeur : Paris : Tec & Doc , DL 2001 Description matérielle : 1 vol. (VII-248 p.) ISBN : 2-7430-0481-9 Fluorescence spectroscopy Auteur(s) : Brand, Ludwig; Johnson, Michael L. Editeur : San Diego (Calif.) : Academic Press , cop Description matérielle : 1 vol. [...]

[...] En effet on a une majorité de cellules en phase G1/S : 59,2% pour l'ON marqué et 53,1% pour t=1h. De même en phase G2/M on a 18,1% pour l'ON marqué et 22,2% pour t=1h. Ces échantillons se trouvent en majorité dans une phase de synthèse de l'ADN avant de passer aux étapes suivantes du cycle cellulaire. Comparaison de t=2h et ON marqué : Lorsque l'on compare les échantillons t=2h et ON marqué on remarque que la proportions de cellule majoritaire ne sont pas dans les mêmes phases. [...]