Amplification par polymérisation en chaîne (PCR) et application au génotypage

Résumé du document

La PCR ou Amplification en Chaîne par Polymérase (ACP) est une technique de réplication ciblée in vitro mise au point en 1985 par Karry Mullis. Elle permet de cibler un segment d'ADN particulier dans le génome et de l'amplifier. On peut ainsi obtenir d'importantes quantités d'un fragment d'ADN spécifique et de longueur définie à partir d'un échantillon d'ADN complexe et peu abondant.
La PCR se déroule dans un tube, dans lequel on va mettre de l'ADN double brin, des amorces, des désoxyribonucléotides et de l'ADN polymérase. En s'hybridant à l'ADN matrice, les amorces vont délimiter la région d'ADN à amplifier et avec leur extrémité 3' OH libre elles vont servir d'amorce pour l'ADN polymérase. Les dinucléotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) vont être utilisés par l'ADN polymérase pour la synthèse du nouveau brin d'ADN
complémentaire.
Le tube est ensuite placé dans un thermocycleur, ce qui permet d'en faire varier la température pendant des durées programmables ainsi que de répéter les opérations afin de réaliser des cycles. Un cycle est composé de trois étapes : la dénaturation thermique, l'hybridation et l'élongation.

Extraits

[...] On mélanger la solution obtenue et on prélève 1ml dans un tube eppendorf de 1,5ml marqué par nos initiales. On centrifuge alors le contenu du tube eppendorf contenant notre ADN a 6-8000 rpm pendant 1min ou plus selon la taille de notre culot. Puis on enlève le surnageant et on reprend le culot cellulaire dans 500 microlitres de Chelex 10%.On pipette et on refoule à plusieurs reprises afin de bien mettre en suspension les cellules. On referme le tube et on le place sur un support flottant à 56°C pendant 5 min. [...]

[...] En conclusion, la PCR est aujourd'hui une technique très utilisée en biologie moléculaire. Sa découverte a révolutionné la recherche génétique, permettant un gain de temps dans les études et les expériences, mais également une fiabilité dans les résultats et une meilleure connaissance du génome. [...]

[...] Par exemple, les français et les canariens on en général la séquence Alu + qui prédomine alors que chez les camerounais et les anglais ont plutôt Alu Les espagnols ont autant d'Alu+ que d'Alu-. Pour le locus PV92, les 5 populations étudiées ont une prédominance de l'allèle c'est-à-dire que le locus n'est pas présent. Et pour le locus SLC6A3, en général, la population à 10 répétitions dans la séquence ainsi que 9 répétitions. Tandis que les 11 répétitions sont moins présentent. Cette fréquence des allèles à été mise en évidence pour l'ensemble de la promotion. [...]

[...] Exemple de calcul pour TPA : La distance de migration des fragments pour Corre est de 6.0 cm et 4,7cm . Le Log(taille des fragments) est donc : log (taille de TPA) = - + 3,8794 log (taille de TPA) = 2,71333 taille de TPA = 102,71333 =517 pb Autres résultats : B2 - 4 Février : TPA : ; ; ; ; ND PV92 : ND ; ; ; ; ND SLC6A3 : ; NC ; ; ; ND B2 - 15 mars : TPA : ND ; ; ND ; ; ND ; +PV92 : ND ; ; ND ; ; ; -SLC6A3 : ND ; ND ; ; ND ; ; ND A1 - 11 mars : TPA : ND ; ND ; ; ND PV92 : ; ND ; ; -SLC6A3 : ND ; ND ; ; B1 - 11 février : TPA : ; ; ; ; ND ; PV92 : ; ; ; ; ND ; -SLC6A3 : ; ; ; ; ; B1 - 4 mars : TPA : ND ; ND ; ; ; ; +PV92 : ND ; ND ; ; ; ; +SLC6A3 : ND ; ND ; ND ; ; ; A2 - 18 janvier et 17 mars : pas de résultats Détermination du génotypage: Détermination du génotype On cherche à déterminer notre génotype, en s'aidant du site NCBI. [...]

[...] On ajoute ensuite : Tube TPA Tube PV92 Tube SLC H2O stérile 13µL 13µL 10,5µL DMSO 2,5µL dNTP mix 1µL 1µL 1µL Amorce F 0,5µL 0,5µL 0,5µL Amorce R 0,5µL 0,5µL 0,5µL Dans un autre tube gardé dans la glace, on prépare du Master-Mix 2X pour trois tubes avec : - H2O stérile 50µL -Tp PCR 10X 16µL -MgCl2 25mM 13µL -Taq polymérase 0,8µL On centrifuge 3 secondes, puis on transvase 25µL de Master-Mix 2X dans chacun des 3 tubes PCR. On centrifuge de nouveau puis on ajoute 10µL de nos cellules lysées dans chacun des 3 tubes PCR. On ferme bien les tubes, on les centrifuge 3 secondes afin de faire tomber la vapeur d'eau condensée au fond du tube. III) Résultats On veut déterminer la taille des fragments amplifiés pour chacune des pistes. [...]