L’amorce du MPF (M-Phase promoting factor) au cours de la maturation méiotique de l’ovocyte de Xénope

Résumé du document

L'objectif de ce TP visait à améliorer la compréhension des mécanismes présidant à l'activation du moteur moléculaire assurant l'entrée en division des cellules eucaryotes : le MPF (M-Phase promoting Factor). Pour cela, le modèle d'étude sélectionné a été les divisions méiotiques de l'ovocyte de Xénope. Les ovocytes de Xénope sont naturellement bloqués en prophase de méiose I. En réponse à la progestérone, vont être déclenchés les événements nécessaires à la reprise de la méiose, l'un de ces événements est la rupture de l'enveloppe nucléaire, ou GVBD (Germinal Vesicle BreakDown), un stade facilement visualisable grâce à l'apparition d'une tache claire de dépigmentation au niveau du pôle animal de la cellule. Les cellules reprennent donc la méiose et se bloquent à nouveau en métaphase II en attente de la fécondation. Ce processus, appelé maturation méiotique, est sous le contrôle du complexe Cdc2-Cycline B, facteur universel de division des cellules eucaryotes. Nous nous sommes intéressés à l'étude des mécanismes régulant le passage de ce complexe de l'état inactif (Pré-MPF) à l'état actif (MPF) au cours de la maturation méiotique.

Différentes protéines kinases et protéines phosphatases, sont impliquées dans la régulation du MPF lors de la reprise méiotique. Des sa synthèse, la cycline B interagit avec Cdc2 pour former un complexe le pré-MPF, ce dernier est maintenu inactif par la phosphorylation de Cdc2 sur les résidus thréonine 14 et tyrosine 15.

Extraits

[...] Anti protéases : permet la non-dégradation des protéines. Orthovanadate : bloque les phosphatases. Après homogénéisation, on a centrifugé nos homogénats pour ensuite prélevé 20µl de surnageant qui correspond à la fraction soluble des ovocytes et contient les protéines. Nous y avons ajouté un tampon de charge qui contient du SDS pour dénaturer les protéines et les charger négativement à fin qu'elles puissent toute migrer vers le pôle positif de la même manière et que leur taille soit le seul facteur de différenciation lors de la migration, il contient aussi du bleu de bromophénol pour suivre leur migration dans le gel. [...]

[...] Lot 2 : GVBD Des ovocytes incubés en présence de 1µM de progestérone qu'on a récupéré juste après la rupture de l'enveloppe nucléaire (apparition d'une tache claire) GVBD. Lot 3 : Méta II Des ovocytes incubés en présence de 1µM de progestérone qu'on a récupéré 2heures après GVBD (bloqués en Métaphase II) Lot 4 : CHX Des ovocytes traités avec du cyclohéximide (un inhibiteur de la synthèse protéique), ensuite incubés en présence de progestérone. On a récupéré ces ovocytes au même moment que les Pro I et les Méta II. Manipulation 1 : Fixation des ovocytes. [...]

[...] Cette étape se fait après avoir décoloré et lavé la membrane avec du TBST x 2min) pour ensuite les agiter avec du TBST + 10% de lait et relaver la membrane. - Immunoblot et révélation : Pour pouvoir identifier la protéine que nous recherchons, nous avons procédé à un immunomarquage ou la protéine joue le rôle d'antigène face à des anticorps spécifiques (anticorps primaires), et à fin de détecté l'expression de cette protéine, nous avons utilisé un deuxième anticorps (anticorps secondaire) qui détecte les anticorps primaires préalablement fixés sur la protéine d'intérêt et amplifie le signal. [...]

[...] On en déduit que la maturation est inductible in vitro par un traitement à la progestérone. Par contre après traitement avec du cycloheximide (inhibiteur de la synthèse protéique), nous remarquons que même après incubation en présence de progestérone, il n'y a pas apparition de tache claire et l'enveloppe de la vésicule germinative toujours présente après avoir coupé les ovocytes, donc pas de maturation, on en déduit que la maturation induite par la progestérone dépend d'une synthèse protéique (CHX sensible). Figure 2 : La figure 2 représente un western blot ou on voit l'expression des différentes protéines impliquées dans le mécanisme d'auto-amplification de MPF pour les différents traitements. [...]

[...] L'inhiber via MPF actif, mais aussi avec l'intervention de la voie Mos/MEK/MAPK qui phosphoryle Myt1. Cela dit, l'autre hypothèse qu'on peut proposer suggère que si on a du Cdc2 actif libre (phosphorylé sur le résidu thréonine161), la synthèse d'une nouvelle cyclineB pourra conduire à la formation d'un peu de MPF actif (sans la phosphorylation de Cdc2 sur les résidus thréonine 14 et tyrosine ce MPF actif suffirait à lancer toutes les boucles citées précédemment (Cdc25, Myt1) et lancer donc la formation de la quantité nécessaire de MPF. [...]