Un nouveau peptide transporteur pour un adressage efficace des antigènes et des acides nucléiques vers les cellules dendritiques

DAVINA R.

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Un nouveau peptide transporteur pour un adressage efficace des antigènes et des acides nucléiques vers les cellules dendritiques

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La présentation de l'antigène par les cellules dendritiques (un des types de réponse de l'immunité innée caractérisée par une action de défense immédiate de l'organisme) permet d'activer l'immunité adaptative (action des Lymphocytes B, LBs et des Lymphocytes T, LTs ). Concernant les LTs, l'antigène exogène est présenté aux cellules T CD4+ (Lymphocytes T auxiliaires) par les molécules CMH (Complexe Majeur d'Histocompatibilité) de classe II et l'antigène endogène aux cellules T CD8 (Lymphocytes T cytotoxiques) par les molécules CMH de classe I. La réponse adaptative conséquente est la différenciation de la cellule T naïve en cellule T effectrice, sécrétrice de cytokines (molécules de signalisation cellulaire dont les Interleukines IL, Facteurs de Nécrose Tumorale TNF, chimiokines, Facteurs de Stimulation des Colonies CSF) pour les LT CD4+ ou de molécules cytotoxiques pour les LT CD8+. Une sous-population de LT CD4+, les Tregs participent à l'homéostasie (conservation du milieu intérieur en équilibre) en inhibant la prolifération des effecteurs. Après élimination de l'antigène, la plupart des LTs meurent. Des LTs mémoire survivent, susceptibles de répondre plus rapidement à une seconde infection par le même antigène.

Sommaire

Rapport des travaux antécédemment mêmes
1. Principe d'initiation des réponses immunes par les cellules dendritiques (DCs), cellules présentatrices de l'antigène (CPAs) aux cellules T naïves
2. Usage de ce mécanisme immunitaire vers le développement des immunothérapies anticancéreuses
3. Identification des récepteurs exprimés par les cellules dendritiques vers le développement de stratégies de vaccination qui ciblent les DCs à partir de l'utilisation d'anticorps spécifiques à ces récepteurs
4. Étude de l'influence du couplage ou fusion chimique de ces antigènes à des anticorps dirigés vers les cellules dendritiques sur l'activation cellulaire des LTs vers l'optimisation de l'immunogénicité
5. Facilitation de la présentation-croisée des antigènes exogènes par élargissement de la gamme de récepteurs des cellules dendritiques ciblés vers l'induction des lymphocytes T CD8 cytotoxiques
6. Alternative à la libération de l'antigène, l'utilisation de peptides courts avec pénétration tissulaire optimale, synthèse facile et conjugaison aux antigènes
7. Identification des peptides avec spécificité de fixation et/ou de fonction à partir de banques de phages
8. Avantage technologique : Évaluation positive de la spécificité désirée des anticorps du sérum de patient ou de la sélection de peptides fixateurs de cellules cancéreuses à partir de phages
9. Désignation d'une variété de molécules fusionnées à l'un des peptides sélectionnés vers le ciblage de cellules cancéreuses in vivo et in vitro
Définition du projet de recherche dans l'article
1. Hypothèse de départ
2. Enoncé de la problématique
3. Objectifs
4. Analyse statistique
Démarche expérimentale
1. Préparation des cellules dendritiques à partir de Cellules Mononuclées du Sang périphérique (PBMCs) destiné à stimuler les Lymphocytes T (LTs)
2. Etude de la sélection des phages ciblant les Cellules dendritiques immatures (iDCs) par Cytométrie en flux
3. Séquençage de la région nucléotidique unique de la protéine pIII des phages positifs en utilisant des amorces spécifiques M13 après isolement de leur ADN
4. Biotinylation du phage par la Sulfo-NHS-Biotine
5. Analyse de la fixation du phage aux cellules dendritiques par Cytométrie en flux
6. Synthèse des peptides utilisés dans l'expérience
7. Conjugaison des peptides aux siRNA
8. Stimulation autologue des lymphocytes T par des DCs semi-matures (semi-mDCs) préalablement incubés avec les peptides pp65
9. Stimulation autologue des PBMCs HLA-A2/CMV+ avec les peptides NW-pp65 et GA-pp65
10. Étude analytique des dextramères d'antigènes spécifiques HLA-A2 de HIV (Virus du SIDA) et de CMV
11. Analyse phénotypique des cellules dendritiques par immunofluorescence directe
12. Analyse de la fixation des peptides par Cytométrie en flux
13. Observation de la fixation des peptides par microscopie en fluorescence
14. Internalisation des complexes peptides NW-streptavidine-PE par les cellules dendritiques
15. Analyse de la fixation des phages biotinylés aux cellules dendritiques par microscopie à fluorescence
16. Inactivation des gènes par conjugaison des peptides NW et siRNA ou de siRNA libres.
17. Analyse au Western-Blot
Résultats et discussion
1. Sélection des peptides fixateurs de cellules dendritiques
2. Spécificité du phage du peptide NW
3. Adressage par le peptide NW des peptides antigéniques aux cellules dendritiques
4. Adressage de la portion peptidique NW quant à la fixation des peptides pp65 aux DCs
5. Augmentation de la prolifération cellulaire des cellules T du fait du ciblage des cellules dendritiques par les peptides pp65
6. Activation des cellules T naïves en cellules T spécifiques aux CMV-pp65
7. Fixation des peptides aux monocytes sanguins sans entrave à l'activation des LTs
8. Supériorité du récepteur au peptide-NW dans la médiation vers la digestion de l'antigène par rapport à la réaction spontanée des Cellules Présentatrices de l'Antigène (CPAs)
9. Facilitation de l'adressage des siRNA vers les cellules dendritiques par le peptide NW

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Extraits

[...] RÉSULTATS ET DISCUSSION des études montrent que le couplage des antigènes aux anticorps spécifiques aux récepteurs de surface des DCs, comme CD205, Bêta-2 Intégrine CD11c ou le récepteur Lectine de type C Clec9A provoque fréquemment, une induction positive des réponses T. cependant, le développement de stratégies de ciblage additionnelles qui facilite la libération d'antigènes ou d'acides nucléiques vers les cellules immunitaires comme les DCs peut être une alternative efficace (10). IV.1 Sélection des peptides fixateurs de cellules dendritiques le pourcentage de fixation est important au troisième tour de sélection (Fig. [...]

[...] Les NWpp65 développent les LTs pp65 CMV+. Beaucoup des peptides NWpp65 ont été identifiés et peuvent induire une réponse LT CD8+ cytotoxique CMV spécifique en l'absence du virus (15). IV.5 Augmentation de la prolifération cellulaire des cellules T du fait du ciblage des cellules dendritiques par les peptides pp65 la capacité de la protéine de fusion NW-pp65 (60 mer) à activer les LTs a été évaluée (donneurs HLA-A2/CMV+). Des semi-mDCs ont été incubées avec le peptide de fusion NW et les LTs CD4+ et CD8+. [...]

[...] II.2 Énoncé de la problématique est-ce que le peptide de fusion est capable de se fixer avec affinité aux CPAs et de diriger les protéines et les siRNAs vers les DCs pour améliorer la mémoire et les réponses des cellules T naïves ? II.3. Objectifs L'objectif de l'étude consiste en l'élaboration d'une stratégie de fixation, de détection du peptide de fusion préalablement identifié NW aux DCs vers son internalisation et évaluer les effets attendus sur les LTs. II.4 Analyse statistique : Tests de Student avec des valeurs de P [...]

[...] Les LTVSPWY sont les plus petits capables de libérer des antisens vers les cellules cibles. Les oligonucléotides antisens sont complémentaires aux séquences d'ARNm et diminuent l'expression des gènes causant les maladies. L'étude de la libération pourrait requérir des approches sur l'effet de ces protéines sur les cellules cancéreuses parce que la toxicité est limitée en fonction de la dose administrée de ces agents. En effet, une dose faible de peptides peut engendrer une réponse efficace avec toxicité limitée. Lorsqu'on compare la fixation des peptides entre cellules cancéreuses SKBR3 et les cellules PBMCs CD34+ (cellules mononucléées périphériques du sang progénitrices), on observe une coloration plus importante pour les SKBR3 que les CD34+. [...]

[...] L'incorporation à la thymidine tritiée permet de suivre les cellules prolifératives. Celles-ci sont colorées avec des dextramères spécifiques à l'épitope NLVPMVATVpp65. III.9 Stimulation autologue des PBMCs des donneurs HLA-A2/CMV+ avec les peptides NW-pp65 et GA-pp65 Les PBMCs HLA-A2/CMV+ sont incubés avec les peptides et la thymidine tritiée dans une plaque à 96 puits. Ils sont révélés avec des dextramères spécifiques à l'épitope NLVPMVATVpp65 du CMH I. Des PBMCs déplétés en monocytes (qui ne comportent pas l'épitope du CMH sont aussi utilisés. [...]

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